Tijdens de S-fase start de replicatie in zogenaamde replicatie origins. Prokaryoten hebben één origin op het chromosoom, terwijl dit er bij eurkayoten meerdere zijn. Na het initiatiesignaal, komen er replicatiefactoren op het origin te zitten, zorgt helicase voor het openen van de helices en kan de rest van de replicatie machine, waaronder polymerase, zich binden. Het polymerase kan alleen van ‘5 -> ‘3 synthetiseren. Een primase voor een RNA primer, met een 3’ hydroxyl basepaar einde, bindt om polymerisatie te starten. De leading strand kan continu doorgaan met repliceren, terwijl de lagging strand uit korte losse Okazaki fragmenten bestaat. Vervolgens worden de RNA primers vervangen door DNA en kan ligase de fragmenten aan elkaar maken. Proofreading door het polymerase zelf vermindert het aantal fouten door fout geplaatste nucleotiden te verwijderen. Als mismatch repair (MMR), door middel van een exonuclease, daarna nog overgebleven fouten herkent, vernietigt het de nieuw gevormde strand gedeeltelijk.
Mutaties zijn permanente veranderingen in de nucleotidesequentie. Spontane mutatie kan ontstaan als nucleotiden een abnormaal basenpaar vormen. Dit komt doordat iedere base een tautomeer, structurele isomeer, heeft. Doordat de tautomeer na replicatie weer in zijn normalere vorm verandert, leidt dit tot een mismatch. Niet gerepareerd kan dit tot een mutatie leiden bij de volgende replicatie. Onder de basenpaar substituties vallen transities en transversies. Als een pyrimidine of purine door een base uit dezelfde groep wordt vervangen, noemen we het transitie. Verandert een base in een base uit de andere groep is er sprake van een transversie. Zo’n mutatie komt lang niet altijd tot uiting. Het slippen van de template of nieuw gesynthetiseerde streng kan ook tot replicatiefouten leiden, doordat dit meestal tijdens het kopiëren van een repeat. Dit leidt tot insertie of deletie van één of twee basen in de DNA sequentie en in de meeste gevallen tot een frame shift mutatie als het zich in de coderende regio van een gen bevindt.
Endo- en exogene bronnen kunnen ook spontaan verlies of schade aan basen veroorzaken. De intrinsieke instabiliteit van het DNA leidt spontaan tot deaminatie en depurinatie, het verlies van base en daarmee creatie van een (AP) site. Endogene bronnen leiden onder tot oxidatie en methylatie. Exogene bronnen, die schade toebrengen, zijn ioniserende straling (X-rays), uv-licht en sigarettenrook. Ioniserende schade zorgt voor enkel- en dubbel strand breaks, gemodificeerde DNA basen en apurinische locaties (purine is verwijdert). Uv-licht veroorzaakt vooral covalente bindingen tussen naast elkaar gelegen pyrimidines.
Omvangrijke DNA additieproducten, ontstaan door uv-licht of chemische endogene stoffen, verstoren de DNA helix, waardoor het niet goed meer gerepliceerd kan worden. Bij Cross-links zijn ook twee basen verbonden op dezelfde streng (intrastrand) of van verschillende strengen (interstrand) en heeft dezelfde gevolgen. Er zijn verschillende DNA herstel pathways, die DNA laesies al herkennen en verwijderen vóór de replicatiefase. Anders kan het cellulaire processen als transcriptie en replicatie verstoren met als gevolg het stilleggen van de celcyclus of geprogrammeerde celdood of veroorzaakt het mutaties.
Photolyasen zijn enzymen, die fotoproducten van uv-licht in hun oorspronkelijke vorm kunnen omzetten (niet in zoogdieren). Andere enzymen, waaronder O6-methyl-G DNA methyltransferase (MGMT), haalt de alkyl groep van de base af en bindt het zelf aan zijn eigen polypeptideketen, waarna het inactief wordt en zichzelf vernietigt.
Base excisie repair (BER)
Laesie-specifieke DNA glycosylasen hydrolyseren de base-suiker verbinding en verwijderen zo de beschadigde purine of pyrimidine uit het DNA. AP endonuclease creëert vervolgens een enkel strand break in de backbone. Polymerase β pakt het benodigde nucleotide, dRPase verwijdert de ‘oude’ suiker-fosfaatgroep (backbone). DNA ligase verbindt de keten met de nieuwe nucleotide.
Nucleotide excisie repair (NER)
NER verwijdert vooral mutagene en toxische DNA laesies en herkent vooral de veranderde confirmatie in plaats van de laesie zelf. NER substraten zijn o.a. PAHs, UV geïnduceerde CPDs en (6-4)PPs. XPC-HR23B zorgt voor herkenning van de DNA schade, XPA verifieert dit en RPA is het enkel strand DNA bindingscomplex. Vervolgens wordt de helix geopend en de laesie begrenst. Incisies aan beide kanten van de laesie zorgen voor verwijdering van de beschadigde DNAstreng (excisie), waarna streng weer wordt gerepliceerd door polymerase (reparatie synthese), opgevuld en aan elkaar gebonden door ligasen (ligase). Er zijn twee typen NER, die werken volgens hetzelfde mechanisme, maar met een andere initiatie van schade herkenning. Global Genome Repair (GGR) herstelt DNA schade overal in het genoom, terwijl Transcriptie-Coupled Repair (TCR) op actieve genen op de strand waar transcriptie plaatsvindt effectiever hersteld.
NER is vooral een belangrijke verdedigingsmechanisme tegen de effecten van uv-licht. Een defect in een van de betrokken eiwitten kan dan ook leiden tot een van de volgende recessieve syndromen: xeroderma prigmentosum, syndroom van Cockayne en trichothiodistrofie.
Exo- en endogene factoren kunnen dubbel strand breaks veroorzaken, wat de transcriptie en replicatie na dit punt blokkeert. Dit kan leiden tot degradatie en daarmee het verlies van genetische informatie. Het herstel gaat via twee pathways.
Genetische informatie wordt afgelezen van een ander homoloog chromosoom, meestal een zusterchromatide. Hierbij kan cross-over of omkering van genen optreden. Zie artikel blz. 9 voor een duidelijk plaatje
Single strand annealing (SSA)
is een subpathyway, waarbij korte repeat sequenties de break markeren. Deze repeat units vormen een basenpaar, de niet-complementaire ssDNA uiteinden worden eraf geknipt en er vindt ligatie plaats.
Niet-homologe end joining (NHEJ)
Een heterodimer bindt simpelweg de twee eindes rond de break aan elkaar vast. Dit proces leidt dan ook vaak tot verlies van genetische informatie of translocatie. Afhankelijk van het soort of het stadium in de celcyclus vindt er HR dan wel NHEJ plaats. HR is namelijk vooral effectief tijdens de S- en G2-fase, als er al zusterchromatiden zijn gevormd. NHEJ speelt een belangrijke rol tijdens G0 en G1. Op de overgang G1-S en G2-M zijn belangrijke checkpoints van de celcyclus.
Mismatch herstel (MMR)
Replicatiefactoren en mismatch eiwitten herkennen de mismatch, die tijdens replicatie is ontstaan. Vervolgens maken de eiwitten een incisie, zorgt exonuclease voor het verwijderen van de nieuw gevormde strand en DNA polymerase hervat de replicatie. Als DNA herstel mechanismen de schade niet kunnen herstellen, moet de cel een bypass vormen voor DNA laesies om celdood te voorkomen. Er zijn twee pathways om dit te doen:
DNA schade vermijden
Een replicatievork, ontstaan door DNA schade, op de template streng stopt de replicatie. De nieuwe strand van de dichtbijgelegen zusterchromatide zal dan als template dienen om toch het stuk geblokkeerd DNA te repliceren. Na de bypass leest de nieuwgevormde streng weer van de oorspronkelijke templatestreng af.
Translaesie synthese (TSL)
Het replicatie polymerase delta/epsilon kan niet langs een beschadigt nucleotide en wordt vervangen door een TSL polymerase. Deze is niet zo specifiek voor de template en kan daarom over het beschadigde nucleotide heen repliceren. Na het bypassen van de schade, neemt het replicatie polymerase het weer over. Doordat TSL niet specifiek is, bouwt het soms het verkeerde nucleotide in, wat in de volgende replicatiecyclus tot een mutatie leidt. Het is dus een grote oorzaak voor mutaties, maar voorkomt celdood. Hierdoor kan het ook kanker veroorzaken.
Op basis van de veranderingen, die ze teweeg brengen, kun je mutaties classificeren.
Puntmutaties/Intragene mutaties
Deze ontstaan door substitutie van een basepaar voor een ander (transitie/transversie) of de additie/deletie van een klein aantal basenparen, wat tot frameshifts leidt. Een mutatie in het coderende deel, noemen we ook wel een intragene mutatie, omdat het meestal maar effect heeft op één gen. Een nonsense mutatie veroorzaakt een stopcodon en daarmee verminderde functie van het eiwit. Een missense mutatie veroorzaakt de verandering van één aminozuur en kan verminderde functie met zich mee brengen, maar het kan ook ongemerkt gaan. Een framshift veroorzaakt vaak een stopcodon en een eiwit met verminderde functie.
Chromosomale mutaties
Dit zijn deleties, tussenvoegingen, omzetting of duplicaties in het coderende deel van meerdere genen. Samenvoegen van gebroken chromosomen of abnormale distributie over de dochtercellen tijdens het scheiden van de chromosomen is meestal de oorzaak. Deze mutaties kunnen vaak leiden tot een verlies van heterozygositeit (LOH). Veel mutagene events hebben LOH tot gevolg, wat weer nauw samenhangt met het ontstaan van kanker.
Signaal transductie pathways, die de celcyclus stopzetten of apoptose induceren, zijn essentieel voor alle beschermingsmechanismen. Checkpoints van G1-S, tijdens de S-fase en van G2-M kunnen de celcyclus tijdelijk stopzetten, zodat de schade kan worden hersteld (cell cycle arrest).
Bij te ernstige schade gaat de cel dood of in een irreversibele verouderingsachtige staat. Cycline afhankelijke kinasen reguleren de progressie van een cel. Het p53 tumor suppressor gen is betrokken in de controle van checkpoints. Een deficiëntie leidt dan ook tot het verlies van het G1/S checkpoint. Het ATM gen veroorzaakt de ziekte ataxia telangiectasie en is een upstream regulator van p53. Na ioniserende straling stabiliseert en activeert het namelijk p53. P53 speelt ook een rol bij de apoptose om mutagene consequenties te vermijden.
Mutaties in genen die betrokken zijn bij de reparaties van mutaties kunnen op verschillende manieren tot uiting komen:
De functie kan worden overgenomen door andere genen, komt niet tot uiting.
Wanneer beide allelen gemuteerd zijn, ontstaan ernstige ontwikkelingsstoornissen.
De mutatie van beide allelen is niet verenigbaar met het leven.
Heterozygoot geeft ontwikkelingsstoornissen omdat de concentratie van het genproduct in de cel belangrijk is.
