Samenvatting literatuur - Van cel tot molecuul (Thema 2: Nucleïnezuren en eiwitten) - Geneeskunde UL - 2019/2020

Thema 2: Nucleïnezuren en eiwitten

Essential Cell Biology - Alberts, Hopkins - 4e druk

Replicatie, herstel

Hoe werken DNA replicaties, reparaties en recombinaties? - Chapter 6

De diversiteit aan levende organismen hangt af van de genetische veranderingen door miljoenen jaren heen. Om te overleven en reproduceren moeten individuen genetisch stabiel zijn. De meeste DNA schade is tijdelijk en wordt gecorrigeerd door een proces genoemd DNA herstel. Wanneer het herstel faalt, zal er een irreversibele mutatie ontstaan in het DNA, die kan leiden tot een verandering van het eiwit. Een mutatie in geslachtscellen zal worden doorgegeven aan elke cel van het multicellulaire organismen en aan de opvolgende generaties. De andere somatische cellen moeten worden beschermd tegen genetische verandering tijdens het leven van de individu.

Hoe werkt DNA replicatie?

De beide strengen van de dubbele helix van het DNA bevatten een nucleotidevolgorde die complementair is aan de nucleotidevolgorde van de andere streng. Als we de ene streng A noemen en de andere streng B, vormt streng A een template streng voor streng B, en andersom. Bij replicatie van streng A ontstaat een nieuwe streng B en bij replicatie van streng B ontstaat een nieuwe streng A. Een streng die gebruikt wordt voor replicatie heet een template, de nieuwe streng die langs de template gevormd wordt, heet een replicate. Doordat het mogelijk is om replicates te maken, is de cel in staat om zijn genen te kopiëren. Het kopiëren wordt uitgevoerd door een aantal proteïnen die samen een replicatiemachine vormen.

Bij DNA-replicatie ontstaan uit één dubbele helix twee dubbele helices, die identiek zijn aan het oorspronkelijke DNA. Elke streng van de dubbele helix dient als een template voor een nieuwe streng. Daardoor bevat elke kopie van het DNA uiteindelijk één streng van het originele DNA, en één replicate. Deze vorm van replicatie heet semi-conservatief.

De dubbele helix is normaal gesproken gesloten. De twee strengen worden bij elkaar gehouden door een groot aantal waterstofbruggen tussen de basen van beide strengen. DNA-replicatie begint met het ontwinden en scheiden van de twee strengen. Door proteïnes worden de waterstofbruggen tussen de twee strengen verbroken en gaan de strengen uit elkaar. De stoffen die dit veroorzaken heten initiator proteins. De plaatsen waar het DNA geopend wordt, heten replication origins. Deze zijn te herkennen aan een bepaalde nucleotidevolgorde. Deze origins trekken de initiator proteins aan en bevinden zich op delen van het DNA dat makkelijker te openen is (meestal bij A-T paren vanwege minder waterstofbruggen).

Op de plaats waar het DNA geopend wordt door een initiator, worden eiwitten aangetrokken die bij het replicatieproces betrokken zijn. Deze groep van eiwitten vormen de replication machine. DNA moleculen die gerepliceerd worden, bevatten Y-vormige knooppunten die we replicatievorken noemen. Bij deze vorken verplaatst de replication machine zich langs het DNA. De machine opent beide strengen en gebruikt elke als een template om een replicate te vormen. Per replication origin worden twee replicatie vorken gevormd en deze bewegen zich in tegenovergestelde richting. Het proces van DNA replicatie heet daarom bidirectional.

Een enzym dat belangrijk is bij de DNA replicatie is DNA-polymerase. Dit enzym katalyseert het toevoegen van een nucleotide aan het 3’-uiteinde van een replicate. Het helpt een binding te vormen tussen het 3’-eind van de replicate en de fosfaatgroep (5’-eind) van de nieuwe nucleotide. Voor de reactie heeft plaatsgevonden bevatten de vrije nucleotiden energie. De vrije nucleotiden zijn trifosfaten. Bij de hydrolyse van een trifosfaat worden twee fosfaatgroepen van de vrije nucleotide afgesplitst.

Hierbij komt energie vrij die de vorming van de binding tussen de vrije nucleotide en de replicate mogelijk maakt. Het DNA polymerase zorgt ervoor dat de energie benut wordt voor de verbinding tussen de nucleotide en de replicate.

De replicatie kan slechts in één richting plaatsvinden, namelijk in de richting van het 5’-uiteinde naar het 3’-uiteinde. De twee strengen van het DNA-molecuul hebben echter een tegenovergestelde richting. Als gevolg hiervan wordt één nieuwe DNA-streng gemaakt langs een template die van 3’ naar 5’ loopt. De andere DNA streng wordt echter gemaakt langs een template die van 5’ naar 3’ loopt. Dit is een probleem, omdat DNA-polymerase alleen een replicate van 5’ naar 3’ kan maken.. Bij de replicatie van deze streng wordt dit probleem opgelost door telkens kleine stukjes te repliceren in de richting van het 5’-uiteinde naar het 3’-uiteinde, en deze korte fragmenten te koppelen. Deze korte fragmenten heten Okazaki-fragmenten. De streng die op deze manier gerepliceerd wordt heet de lagging strand. De streng die in een keer gerepliceerd wordt heet de leading strand.

DNA-polymerase heeft twee bijzondere eigenschappen die ervoor zorgen dat de DNA-replicatie bijna zonder fouten plaats kan vinden. Ten eerste controleert het polymerase of de combinatie van twee nucleotiden juist is (A-T en C-G). Alleen wanneer de combinatie klopt, katalyseert het polymerase de bindingsreactie. Ten tweede kan het polymerase een gemaakte fout herstellen door middel van proofreading. Proofreading vindt tegelijkertijd plaats met de synthese van DNA. Voordat een nieuwe nucleotide aan de groeiende, nieuwe DNA-streng wordt gebonden, wordt er eerst gecontroleerd of de basenparing van de voorafgaande nucleotide klopt. Als dit het geval is, gaat de replicatie verder. Als dit niet het geval is, wordt de foute nucleotide verwijderd en probeert het polymerase het opnieuw.

Polymerase kan zelf geen begin maken aan een nieuwe DNA-streng. Hier is een ander enzym voor nodig, namelijk het primase. Dit enzym synthetiseert echter geen DNA, maar maakt een klein stukje RNA langs de DNA-template. Dit RNA bestaat uit ongeveer tien nucleotiden en dient als primer voor de synthese van DNA. Deze primer is met basen van de template gepaard en bevat een 3’-eind waaraan polymerase nieuwe nucleotide kan koppelen. Primase is een voorbeeld van een RNA-polymerase. RNA-polymerase synthetiseert RNA waarbij het DNA gebruikt wordt als template. Het verschil tussen DNA en RNA is dat DNA desoxyribose bevat en RNA ribose. Daarnaast wordt bij RNA de base uracil gebruikt in plaats van thymine, waardoor de combinatie U-A voorkomt in plaats van T-A. Een laatste verschil tussen RNA en DNA is dat RNA slechts uit een enkele streng bestaat, terwijl DNA dubbelstrengs is.

Bij replicatie van de leading strand is één primer nodig om de replicatie bij de replication origin te starten. Vervolgens kan de replicatie aan een stuk van 5’ naar 3’ door gaan. Bij replicatie van de lagging strand zijn meerdere primers nodig, omdat DNA-polymerase niet continu over de template kan bewegen. Ook zijn er drie andere enzymen nodig om het geheel van korte stukjes gerepliceerd DNA aan elkaar te plakken. Deze enzymen verwijderen de primers, vervangen deze door DNA, en plakken de stukken aan elkaar.

Een nuclease verwijdert het RNA, een DNA polymerase (repair polymerase) vervangt het RNA door DNA, en DNA ligase plakt de uiteinden aan elkaar.

Voor het voortduren van de replicatie is het nodig dat de twee DNA-strengen van de helix uit elkaar gaan in de richting van de replicatie. Hierbij speelt helicase een belangrijke rol. Aan de voorkant van de replication machine ontbindt helicase de twee DNA-strengen.

Hiervoor is helicase van ATP afhankelijk. Aan de gescheiden strengen binden eiwitten, de zogenaamde single strand DNA-binding proteins, die ervoor zorgen dat de DNA-strengen niet weer terugvormen in een dubbele helix. Het eiwit sliding clamp zorgt ervoor dat DNA-polymerase aan de template vast blijft. Zonder dit eiwit heeft polymerase de neiging om van de template af te vallen. De sliding clamp kan echter pas aan een DNA-molecuul binden, als een zogenaamde clamp loader door middel van ATP-hydrolyse dit mogelijk maakt. Verder is het eiwit DNA-topoisomerase van belang bij de replicatie. Doordat een deel van het DNA uit elkaar wordt gehaald bij een replicatievork, komt er spanning op het DNA dat na de replicatievork volgt te staan. DNA-topoisomerase zorgt ervoor dat deze spanning verdwijnt door een inkeping in de ruggengraat van het DNA te maken en dit later weer te herstellen.

Omdat langs de lagging strand een discontinue replicate wordt gevormd, moet er steeds een nieuwe RNA-primer worden gevormd. Dit zorgt echter voor problemen aan het eind van de streng. Aan het eind van het DNA-molecuul is geen plaats om een primer te binden. Hierdoor zou de replicatie langs de lagging strand eerder stoppen. Eukaryoten hebben aan het eind van hun DNA-strengen een specifieke nucleotidevolgorde, die een telomeer wordt genoemd. Deze telomeren trekken het enzym telomerase aan. Dit enzym bevat een stukje RNA, dat wordt gekoppeld aan de lagging strand. Hierdoor is DNA-polymerase is staat om de gehele lagging strand te kopiëren.

Hoe werkt DNA-herstel?

Af en toe worden er fouten gemaakt in het DNA-replicatie- en repairproces. Als gevolg hiervan ontstaan er permanente fouten in het DNA die we mutaties noemen. Er wordt tijdens replicatie ongeveer 1 fout gemaakt per 107 gekopieerde nucleotiden. DNA mismatch repair is een systeem in de cel dat ongeveer 99% van deze fouten herstelt. Er blijft dus ongeveer 1 fout over in het DNA per 109 nucleotiden. DNA mismatch repair repareert altijd de nieuw gevormde DNA-streng die de mismatch zal bevatten. Een complex van mismatch repaireiwitten herkent een mismatch en herstelt deze na de mismatch te hebben verwijderd.

Het mismatch repairproces speelt een belangrijke rol in het voorkomen van kanker. De erfelijke aanleg voor bepaalde kanker wordt veroorzaakt door een defect in de genen die coderen voor de mismatch repaireiwitten. Mensen hebben twee kopieën van dit gen. Wanneer beide defect raken, worden mutaties niet meer hersteld. Dit vergroot de kans op kanker. DNA-schade als gevolg van onvermijdelijke chemische reacties wordt gerepareerd door verschillende enzymen die DNA-schade herkennen en een kleine reeks nucleotiden verwijderen. Het missende deel wordt aangevuld door een repair DNA-polymerase dat de onbeschadigde streng als template streng gebruikt. DNA-ligase vult de laatste scheurtjes in het DNA op.

De meeste herstelmechanismen zijn afhankelijk van het feit dat er twee kopieën van genetische informatie zijn in de dubbelstrengs DNA helix. De basis van herstel bestaat uit drie stappen:

1) Na herkenning van een DNA schade zal een nuclease het deel eruit knippen.

2) Een herstel DNA polymerase zal het gat opvullen door de kopie streng af te lezen.

3) Een DNA ligase zal de fragmenten aan elkaar plakken.

Voorbeelden van chemische reacties die plaatsvinden zijn:

• Depurinering: purinebasen (dit zijn A en G) laten spontaan los van het DNA. De ruggengraat wordt dus niet verbroken.

• Desaminering: een aminogroep laat spontaan los van de base cytosine. Vervolgens ontstaat de base uracil.

• Thyminedimeervorming: er ontstaat een covalente bindingen tussen twee thymine basen als gevolg van UV-straling.

Een gevaarlijk type DNA-beschadiging ontstaat wanneer beide strengen van de dubbele helix breken. Hierdoor blijft er geen template intact die zuiver herstel mogelijk maakt. In lichaamscellen worden deze breuken gerepareerd door een mechanisme dat nonhomologous end-joining wordt genoemd. De uiteinden worden bij elkaar gebracht door een groep enzymen en aan elkaar gemaakt door DNA-ligase. Er gaan gedurende dit proces echter vaak nucleotiden op de plaats van de breuk verloren. Een betere oplossing is homologous recombination. Dit mechanisme kan dubbelstrengse DNA-breuken betrouwbaar repareren. Het komt erop neer dat er informatie wordt uitgewisseld tussen homologe DNA-moleculen. Informatie die voorkomt op het onbeschadigde homologe DNA wordt gebruikt als voorbeeld om de gebroken DNA-strengen te repareren.

1. (B) Een nuclease zorgt ervoor dat de uiteinden bij de breuk enkelstrengs worden door een stukje van de DNA-strengen te verwijderen.

2. (C) Een van de uiteinden dringt met behulp van enzymen in het homologe DNA en vormt baseparen met de complementaire streng.

3. (D) De binnendringende streng wordt verlengd door DNA-polymerase. Hierbij wordt de complementaire homologe streng als template gebruikt. De binnendringende streng wordt verlengd tot na het punt van de breuk.

4. (E) Vervolgens wordt de dubbele breuk door basenparing weer aan elkaar gemaakt. DNA-polymerase vult de missende nucleotiden op de beide strengen aan.

5. (F) DNA-ligase vult scheurtjes op. Het herstel is compleet.

Patiënten met de genetische aandoening xeroderma pigmentosum kunnen thymine dimeren niet repareren. Deze individuen krijgen last van huidlaesies, inclusief huidkanker, wanneer ze worden blootgesteld aan UV-licht.

Depurinatie is het plotseling verdwijnen van de purinebases (A en G). Bij deaminatie verdwijnt er plotseling een aminegroep, waardoor uracil uit cytosine ontstaat.

Metabolische bijproducten veranderen soms baseparen en UV-straling kan er voor zorgen dat 2 pyrimidine (thymine, cytosine of uracil) covalente verbindingen aan gaan.

De originele streng dient altijd als back-up. Deze is makkelijk te onderscheiden van de beschadigde streng, doordat er door mutaties vaak combinaties worden gevormd die normaal niet bestaan. De drie stappen van reparatie: 1) De beschadiging wordt verwijderd door de strengen uit elkaar te trekken met nuclease. Hierdoor blijft een gat over. 2) DNA polymerase bindt aan het 3’-eind en vult het gat. 3) Ligase heelt de helix.

Er zijn veel verschillende eiwitten nodig voor DNA repair. Wanneer één van deze ontbreekt zoals bij xeroderma pigmentosum, worden mutaties door UV-straling bijvoorbeeld niet verholpen, wat resulteert in kanker. Wanneer beide strengen beschadigd zijn is het mechanisme nonhomologous end-joining nodig. Dit brengt de gebroken delen weer bij elkaar, maar niet foutloos, er gaat meestal informatie verloren. Ook bestaat er homologous recombination. Hierbij wordt er een soortgelijke DNA streng gebruikt als mal. Dit werkt hetzelfde als recombinatie bij meiose. De soortgelijke streng kruist met de beschadigde streng, dit punt heet ‘branch point’. Deze beschermingsmechanismen maken evolutie een langzaam proces. Na miljoenen jaren blijft de essentiële inhoud van DNA behouden.

Bij meiose vindt er recombinatie plaats doordat de homologe chromosoom van de vader een cross-over maakt met de chromosoom van de moeder. De plek van de cross-over is willekeurig, er gaan geen nucleotiden verloren. Deze recombinatie vindt ook plaats bij de voortplanting van veel aseksuele organismen.

Nog een vorm van genetische variatie wordt veroorzaakt door mobiele genetische elementen, transposons, of springende genen genoemd. Deze elementen zitten in alle cellen en kunnen bewegen naar een ander deel van het genoom. Ook virussen zijn een mobiele vorm van DNA, ze kunnen vanuit de ene cel, een andere infecteren. Ze kunnen zich echter niet zelfstandig vermenigvuldigen en hebben hier gastheren voor nodig. Er is te weinig plek in hun DNA/RNA voor het coderen van enzymen voor de replicatie.

Wanneer de elementen niet als DNA maar als RNA bewegen, heten ze retrotransposons. Retrovirussen moeten eerst RNA omzetten in DNA om te kunnen repliceren. Reverse transcriptase is een ongebruikelijk DNA polymerase dat RNA als template gebruikt.

Hoe werkt homologe recombinatie?

Het is ook mogelijk dat er inplaats van een enkelstrengs, een dubbelstrengs breuk ontstaat. Dan is er geen kopie meer beschikbaar. Hier zijn speciale herstel-mechanismen voor. Non-homologous end joining zet twee gebroken uiteinden aan elkaar door speciale enzymen. Vaak gaan hierbij nucleotiden verloren. Bij homologe recombinatie gaan er geen nucleotiden verloren.

Bij homologe recombinatie wordt de genetische informatie gebruikt die ligt op een homologe chromosoom. Een deel wordt als template gebruikt voor de herstel van een dubbelstrengs breuk. Homologe recombinatie speelt ook een rol in de uitwisseling van genetische informatie tijdens de meiose van seksuele reproductie. Na de detectie van een dubbbelstrengs breuk zal een nuclease een enkelstrengs uiteinde genereren. Met hulp van gespecialiseerde enzymen kan deze uiteinde een homologe DNA duplex opzoeken en bij het vertakkingspunt kruizen de twee DNA strengen. Een herstel DNA polymerase vormt baseparen met de complementaire streng en vervolgens zal de streng weer terug migreren naar de plek van de breuk. Een DNA ligase lijmt tot slot het nieuwe stuk DNA aan het breukuiteinde.

Homologe recombinatie kan ook gebruikt worden bij andere typen DNA schades. Het kan ook een rol spelen in de meiose van seksuele reproductie, namelijk de formatie van cross-overs. Hierbij wisselen een moeder en een vader chromosoom genetische informatie uit door middel van speciale meiose enzymen.

Transcriptie

Wat is het verband tussen DNA en proteinen, cel en genoom? - Chapter 7

Hoe werkt DNA transcriptie?

De omzetting van de genetische informatie in DNA naar een product dat een bepaald effect heeft op een organisme of cel, wordt genexpressie genoemd. Om de genetische informatie in DNA tot uiting te laten komen, wordt de nucleotidevolgorde van een gen eerst overgeschreven naar RNA. Dit wordt transcriptie genoemd. Transcriptie begint met de ontwinding van de dubbele helix van een stukje DNA, zodat het gen bereikbaar wordt. Eén van de DNA-strengen dient vervolgens als template voor de synthese van RNA. Transcriptie wordt gekatalyseerd door het enzym RNA-polymerase. Dit enzym verbindt de ribonucleotiden tot een suiker-fosfaatruggengraat. RNA-polymerase beweegt langs de template en synthetiseert de RNA keten van het 5’-einde naar 3’-einde. Ribonucleotiden worden toegevoegd door middel van complementaire basenparing aan de template. De RNA-streng blijft niet gebonden aan de DNA-streng. Vlak nadat een ribonucleotide aan de RNA-streng is gekoppeld, laat deze los van de DNA-streng en herstelt de dubbele helix zich. RNA-polymerase herkent bepaalde reeksen van nucleotiden in het DNA-molecuul en weet aan de hand hiervan waar de transcriptie moet beginnen en waar deze moet eindigen.

RNA en DNA verschillen van elkaar op bepaalde punten. RNA is opgebouwd uit ribose, DNA is opgebouwd uit desoxyribose. RNA bevat de base uracil (U) op plaatsen waar DNA de base thymine (T) zou bevatten. RNA-moleculen zijn enkelstrengs, DNA-moleculen zijn dubbelstrengs. Omdat RNA enkelstrengs is, heeft het de mogelijkheid zich op verschillende manieren op te vouwen (in tegenstelling tot DNA). De functie van DNA is vooral het dragen van informatie. RNA heeft echter zowel structurele, informatieve als katalyserende functies.

Cellen maken verschillende soorten RNA. Allereerst wordt er onderscheid gemaakt tussen mRNA en non-mRNA. mRNA draagt de instructies voor het maken van eiwitten, non-mRNA is RNA dat het eindproduct is van bepaalde genen. Er zijn verschillende soorten non-mRNA:

• rRNA, dat een component van ribosomen is;

• tRNA, dat zich tussen mRNA en aminozuren als adaptor gedraagt;

• miRNA, dat een belangrijke regulator van genexpressie is;

• andere soorten non-mRNA, die een rol spelen in onder andere genregulatie, splicing en het onderhoud van telomeren.

Transcriptie begint op plekken in het DNA die promotors genoemd worden, hier bindt RNA-polymerase aan de DNA-streng. Een promotor is een specifieke reeks van nucleotiden die het startpunt voor de RNA-synthese aangeeft. De transcriptie gaat door totdat RNA-polymerase een terminator bereikt. Dit is een specifieke nucleotidevolgorde die het eind van het gen aangeeft. Op dit punt laat RNA-polymerase los van de template.

Bacterieel RNA-polymerase heeft alleen een sigma factor nodig om een promotor te herkennen en transcriptie te laten beginnen. Eukaryotisch RNA-polymerase vereist een aantal transcriptiefactoren. Zonder deze eiwitten kan RNA-polymerase niet aan het DNA binden en kan de transcriptie niet verlopen. Verder hebben eukaryoten drie verschillende soorten RNA-polymerasen, terwijl bacteriën slechts één soort RNA-polymerase hebben. De verschillende genen van een eukaryoot liggen daarnaast veel verder uit elkaar in het DNA dan de genen van bacteriën. Het laatste verschil tussen eukaryoten en bacteriën, is dat eukaryoten bij transcriptie rekening moeten houden met de compacte vormen van de chromatinestructuur. Bacteriën hoeven dit niet. In eukaryotische cellen vindt transcriptie plaats in de kern, maar translatie gebeurt op de ribosomen in het cytoplasma. mRNA moet daarom door de kernenvelop heen getransporteerd worden. Voordat dit gebeurt, ondergaat het RNA verschillende verwerkingsstappen om de stabiliteit van het RNA te verhogen en het RNA herkenbaar te maken. Het verschilt per soort RNA welke verwerkingsprocessen worden toegepast. Wanneer transcriptie plaatsvindt, rijden de enzymen voor RNA verwerking mee op de staart van RNA-polymerase. Twee verwerkingsstappen die worden toegepast bij mRNA zijn capping en polyadenylation. RNA-capping is het veranderen van het 5’-einde van mRNA. Er wordt een bijzondere G-base met methylgroep toegevoegd. Bij polyadenylation wordt eerst een deel van het 3’-eind afgesneden. Vervolgens worden er vele adeninenucleotiden toegevoegd.

Wat houdt 'slicing' in?

In eukaryotisch DNA zijn de meeste genen opgebouwd uit exons en introns. Exons zijn de coderende stukken DNA. Introns zijn stukken DNA die nergens voor coderen. Zowel exons als introns worden gekopieerd tijdens transcriptie. Introns worden verwijderd uit het RNA door middel van splicing, en exons worden bij elkaar gevoegd. Dit proces wordt gekatalyseerd door kleine ribonucleoproteins, snRNPs. De cel weet welke stukken verwijderd moeten worden, omdat introns reeksen van nucleotiden bevatten die functioneren als aanwijzingen. Van alle gesynthetiseerde mRNA is maar een klein deel bruikbaar voor de cel. Pas nadat mRNA capping, polyadenylation en splicing heeft ondergaan, is het functioneel en kan het vertaald worden naar een eiwit. Het bruikbare RNA wordt van het onbruikbare RNA gescheiden doordat het transport van de celkern naar het cytoplasma selectief is: alleen RNA dat ‘af’ is kan passeren.

Het molecuul dat voor de splicing zorgt heet een spliceosome. Deze bestaat uit small nuclear RNAs (snRNAs), dit zijn speciale RNA moleculen. De snRNAs zijn verbonden met speciale eiwitten, en dit complex heet small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs). De snRNPs vormen de kern van een spliceosome.

Door de splicing kunnen er van één gen vele verschillende eiwitten gemaakt worden, door ze op alternatieve manieren te splicen. Dit proces zou tijdens de evolutie ervoor gezorgd hebben dat er vele nieuwe eiwitten werden gemaakt uit een aantal genen. Na het capping, splicing en polyadenylation is het mRNA klaar om de nucleus uit te gaan.

Hoe werkt de codering van DNA naar eiwit?

Het DNA codeert voor eiwitten, de belangrijkste bouwstenen van de cel, die de structuur en functie van de cel bepalen. Eiwitten verschillen van elkaar doordat de volgorde van de aminozuren waaruit ze zijn opgebouwd altijd anders is. Dit geeft het eiwit een eigen vorm. Omdat er zoveel verschillende combinaties van aminozuurketens zijn, bestaan er ook duizenden verschillende eiwitten.

Als er een bepaald eiwit gemaakt moet worden, wordt eerst het benodigde deel van het DNA overgeschreven op RNA, dit heet transcriptie. Het maken van een eiwit met behulp van informatie van het RNA heet translatie. Ook komt RNA-splicing voor, waarbij stukjes uit het RNA worden geknipt en de sequentie van de aminozuren verandert. De stap van DNA naar RNA naar eiwit heet het centrale dogma, omdat cellen in alle organismes dit doen.

Transcriptie en translatie zijn de manieren waarop de cel zijn genen tot expressie brengt. Een stuk DNA kan vele malen worden getranscribeerd en dus vele stukjes RNA vormen, en een stukje RNA kan meerdere eiwitten maken. Zo kan de cel met maar twee kopieën van het DNA toch in korte tijd veel eiwitten maken. Omdat de snelheid en kwantiteit van het aflezen per stuk DNA verschilt, worden er van sommige eiwitten meer kopieën gemaakt dan van andere. De expressie van elk gen kan door de cel worden aangepast.

De productie van RNA, de transcriptie, is de eerste stap in de genexpressie. RNA verschilt van DNA doordat het ribose in plaats van deoxyribose bevat, het uracil als complementaire base voor adenine heeft in plaats van thymine en het enkelstrengs is en dus geen dubbele helix heeft. Omdat RNA enkelstrengs is, kan het ook op veel manieren gevouwen worden, waardoor het naast de functie om eiwitten te produceren ook structurele en katalytische functies kan hebben.

Transcriptie begint met het openen van de dubbele helix, waarna één van de strengen als template streng dient voor het RNA. Het aangroeien van RNA is vergelijkbaar met DNA-replicatie, een nucleotide die complementair is aan de base in de DNA-streng wordt gezocht en aangehecht. Het transscript is dus complementair aan de template streng. Het RNA vormt geen waterstofbruggen met het DNA en zodra een base goed is aangehecht, maakt het RNA ruimte voor de dubbele helix om weer aaneen te sluiten zodat het DNA niet lang geopend is. RNA is in vergelijking met DNA erg kort, het bevat maximaal slechts enkele duizenden nucleotiden.

De transcriptie wordt geleid door een enzym dat RNA-polymerase heet, dit zorgt voor de di-esterbinding van fosfaat en vormt de 'ruggengraatstructuur' van suikers en fosfaten die het RNA bevat. RNA-polymerase beweegt langzaam over de template streng, waarbij het kleine stukjes van de dubbele helix openbreekt met helicase activiteit en dan de template streng complementeert. Hierbij gebruikt het de energie van de ribonucleaire trifosfaten (ATP, UTP, CTP en GTP). Omdat RNA vrijwel meteen de template streng weer loslaat kan hetzelfde gen in kortere tijd vaak getranscribeerd worden. Transcriptie gaat sowieso erg snel, een gemiddeld RNA-molecuul bestaat uit ongeveer 1500 nucleotiden en wordt in 50 seconden gevormd.

De verschillen tussen RNA-polymerase en DNA-polymerase zijn dat RNA-polymerase ribosenucleotiden aan elkaar hecht in plaats van deoxyribosen, en dat RNA-polymerase zonder primer kan beginnen met de vorming van een streng. Dit laatste heeft ermee te maken dat RNA-polymerase geen controlerende functie heeft zoals DNA-polymerase, dit is ook niet nodig want fouten in het RNA hebben veel minder consequenties dan fouten in het DNA.

In de cel bevinden zich meerdere soorten RNA. Het RNA dat getranscribeerd wordt en dus voor aminozuren codeert, noemen we mRNA (messenger-RNA). Andere soorten RNA hebben een structurele functie of helpen bij de translatie, zoals rRNA (ribosomaal-RNA), dat het grootste deel van de ribosomen vormt en tRNA (transfer-RNA), dat de aminozuren levert waar de ribosomen het eiwit van maken. Er bestaat ook miRNA (micro-RNA) dat helpt bij de genexpressie, en andere RNA-vormen voor bijvoorbeeld RNA-splicing. (zie tabel 7-1 op p.228)

Het beginpunt van de transcriptie is bij bacteriën een bepaalde basenvolgorde in het DNA, de promotor genoemd. Hier wordt de dubbele helix geopend en dient een van de stengen als template streng. Transcriptie gaat door tot het een stopcodon, de terminator, tegenkomt, waarbij RNA-polymerase zowel de template streng als het gevormde RNA loslaat. De herkenning van de promotor wordt gedaan door een deel van het bacteriële polymerase, de sigmafactor, welke na transcriptie van een aantal nucleotiden loslaat. Als de polymerase de template streng loslaat, bindt het weer met zo'n sigmafactor en kan het een volgend deel van het DNA transcriberen. Ondanks dat de promotor de dubbele streng opent en dus twee strengen als template streng zouden kunnen dienen, wordt maar in één richting op één van de strengen getranscribeerd, dit omdat het RNA-polymerase maar op een streng wordt vastgehecht en er alleen in de 5'- naar 3'-richting nieuwe nucleotiden verbonden kunnen worden. De streng waarop getranscribeerd wordt, verschilt per gen.

Transcriptie in eukaryoten lijkt op transcriptie in bacteriën, maar er zijn essentiële verschillen. Ten eerste hebben eukaryoten drie soorten RNA-polymerase in plaats van één. Polymerasen I en III zorgen voor het niet-coderende RNA zoals rRNA en tRNA, RNA polymerase II zorgt voor het mRNA en wordt meestal gewoon RNA-polymerase genoemd. Daarnaast is er voor transcriptie in een eukaryote cel een collectie helpende eiwitten nodig, deze heten de general transcription factors. Ook liggen bij de eukaryoten de coderende delen van het DNA verder uit elkaar en zijn er veel complexere vormen van transcriptie mogelijk. Als laatste is het DNA van eukaryoten veel beter verpakt en moeilijker af te lezen dan bacterieel DNA.

Wat houden General Transcription Factors (GTF) in?

General transcription factors zijn nodig voor de transcriptie. Ze binden aan de promotor, binden de RNA polymerase 2, openen de helix en lanceren de RNA polymerase. De eerste GTF die bindt is TFIID. TFIID bindt aan een TATA box, een volgorde van nucleotiden T-A-T-A- enzovoort. Deze TATA box zit enkele nucleotiden vóór het begin van het gen. Na de binding zorgt de TFIID dat er een grote verandering optreedt in het DNA, en de andere GTFs binden ook. Samen met de andere GTFs bindt RNA polymerase 2 ook. Al deze eiwitten samen heten het transcription initiation complex. De RNA polymerase 2 zit dan nog vast in het transcription initiation complex. RNA polymerase 2 heeft een soort “staart” waar fosfaat groepen aan kunnen binden. GTF TFIIH heeft een protein kinase enzyme, waardoor het de staart kan fosforyleren en de RNA polymerase 2 los kan komen van het transcription initiation complex. Zo kan de RNA polymerase 2 beginnen met de transcriptie.

Als de RNA polymerase 2 weg is laten de GTFs los en kan er weer een nieuw complex opgebouwd worden. Na de transcriptie kan de RNA polymerase 2 alleen een nieuw complex vormen als de fosfaat groepen van de staart af zijn gehaald door fosfatases.

De general transcription factors verzamelen rond de promotor, helpen bij het aanhechten van RNA-polymerase, openen de dubbele helix en zetten RNA-polymerase in werking. Eerst hecht het zogenoemde TFIIB (vanwege zijn vele A's en T's ook wel de TATA box genoemd) aan de promotor (ongeveer 25 nucleotiden voor het beginpunt van de transcriptie), de promotor valt nu meer op. Hier komen de andere factoren en RNA-polymerase II op af en wordt het transcription initiatie proces gevormd. Voor RNA-polymerase met de transcriptie kan beginnen, moet het uit dit proces losraken. Dit gebeurt door fosfaatgroepen aan de staart van polymerase te koppelen met behulp van kinase, een enzym van factor TFIIH. Als de transcriptie in gang is gezet laten de meeste general transcription factors de streng los om elders een andere transcriptie te beginnen. Na de transcriptie laat ook RNA-polymerase los en worden de fosfaatgroepen eraf gehaald door fosfatase en kan het aan een andere transcriptie beginnen.

In bacteriën wordt het mRNA in het cytoplasma gevormd en kan translatie door de ribosomen meteen plaatsvinden. In eukaryoten wordt het mRNA gevormd in de nucleus en wordt deze pas getransporteerd naar het cytoplasma als het mRNA klaar is. De bewerkingen die plaatsvinden om het mRNA klaar te maken voor translatie wordt RNA processing genoemd. Deze bewerkingen vinden tegelijk met de transcriptie plaats. Verschillende RNA-soorten hebben verschillende processen, kenmerkend voor mRNA zijn capping en polyadenylation. Capping houdt in dat aan het 5'-einde een guaninenucleotide met een methylgroep wordt gekoppeld als er ongeveer 25 nucleotiden zijn aangebouwd en bij polyadenylation wordt het RNA-molecuul op een bepaalde plek afgeknipt en wordt aan het 3'-einde een keten van enkele honderden adeninenucleotiden (een poly-A-staart) gehecht. Beide zijn om het mRNA te stabiliseren, te helpen bij het transport naar het cytoplasma en om het mRNA te kenmerken. Daarbij is hieraan te zien of het mRNA compleet is, omdat zowel het begin als het eind worden gemarkeerd.

Alle soorten RNA van eukaryoten bevatten delen die niet coderen, de introns genoemd, en de wel coderende delen, de exonen. Introns zijn meestal langer dan exonen. Bij RNA-splicing worden de introns uit het pre-mRNA verwijderd. In de buurt van elk uiteinde van een intron zit een korte nucleotide sequentie die zich herkenbaar maakt om verwijderd te worden. Nadat introns zijn losgeknipt, vormen ze een soort lus. Small nuclear RNA (snRNA) herkent de grens tussen exon en intron. snRNA wordt verpakt in bepaalde eiwitten en samen vormen ze small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNP’s). Spliceosomen bestaan uit snRNP’s, die zorgen voor de splicing. Bij alternatieve splicing kunnen er ook exonen uitgeknipt worden. Door alternatieve splicing, kan mRNA op verschillende manieren in elkaar worden gezet en dus verschillende eiwitten produceren. Alternatieve splicing treedt op bij 60% van alle RNA’s. Daarbij zorgen introns ook voor snellere recombinatie tussen verschillende genen en dus voor de evolutie van eiwitten.

Het hebben van introns heeft ook een nadeel, het genoom is veel langer dan als het alleen exonen zou bevatten. Hierdoor kunnen prokaryoten, die geen introns hebben, veel sneller delen dan eukaryoten. Of introns altijd al bestonden maar door prokaryoten uit het genoom zijn gestoten of dat introns overblijfselen van parasitair genetisch materiaal zijn, is niet duidelijk.

Alleen volledig bewerkt mRNA kan van de nucleus naar het cytoplasma getransporteerd worden. Transport wordt mogelijk gemaakt door het nucleaire porie complex, bestaande uit gaten die macromoleculen de nucleus in en uit laten. Het mRNA wordt gemarkeerd door verschillende eiwitten, zoals het ‘cap-binding complex’ en de ‘poly-A-binding proteins’ en geven aan dat alle stappen zijn doorlopen. Het RNA wat achterblijft wordt afgebroken.

Omdat mRNA meerdere keren kan worden afgelezen, is de levensduur in het cytoplasma erg belangrijk. De levensduur van het mRNA wordt door het mRNA zelf geregeld, meestal in een deel tussen het 3'-eind van het coderende deel en de poly-A-staart. Sommige mRNA’s hebben een levensduur van 10 uur en sommige maar van 30 minuten. Eiwitten waarvan er veel nodig zijn hebben mRNA dat lang leeft, eiwitten waarvan er weinig nodig zijn of waarvan de kwantiteit snel moet kunnen veranderen hebben kort levend mRNA.

Wat is de correspondentie van RNA naar eiwit?

De nucleotiden reeks in mRNA wordt gelezen in setjes van drie nucleotiden. Een setje van drie nucleotiden wordt een codon genoemd. Elk codon correspondeert met een bepaald aminozuur. Welk codon correspondeert met welk aminozuur is vastgelegd in de genetische code. De mogelijke combinaties van de vier verschillende nucleotiden in RNA geven 64 verschillende, mogelijke codons. Sommige codons corresponderen dan met hetzelfde aminozuur.

Translatie van mRNA naar eiwit vindt plaats in het cytoplasma op ribosomen. Translatie vindt plaats aan de hand van adaptormoleculen die codons van het mRNA herkennen. Deze adaptormoleculen zijn kleine RNA-moleculen en worden transfer RNA’s (tRNA’s) genoemd. Dit tRNA is op een speciale manier opgevouwen door basenparing.

Het bevat een reeks van drie nucleotiden, het anticodon genaamd, dat kan binden aan een codon in het mRNA door basevorming. Daarnaast heeft het tRNA aan zijn 3’-einde een bindingsplaats voor een aminozuur. Aminoacyl-tRNA synthetases zijn enzymen die aminozuren linken aan de passende tRNA-moleculen. De binding van het aminozuur aan het tRNA komt tot stand door hydrolyse van ATP. Er ontstaat hierdoor een energierijke binding. De energie van deze binding wordt later gebruikt om het aminozuur aan de peptideketen te koppelen.

Een ribosoom heeft een bindingsplaats voor een mRNA-streng, maar ook bindingsplaatsen voor tRNA-moleculen. Er zijn drie bindingsplaatsen voor tRNA’s: de A-plaats, P-plaats en E-plaats. Op de A-plaats bindt een tRNA-molecuul met het juiste codon op het mRNA. Op dat moment bevindt zich ook een tRNA-molecuul op de P-plaats. Dit tRNA-molecuul houdt de polypeptideketen die gesynthetiseerd wordt, vast. Vervolgens wordt het aminozuur van het tRNA op de A-plaats verbonden met de polypeptideketen die wordt vastgehouden door het tRNA op de P-plaats. Hierna komt het tRNA dat zich op de A-plaats bevindt, op de P-plaats terecht. Tot slot schuift het tRNA door naar de E-plaats, waar het tRNA weer van het geheel loslaat.

Translatie bij eukaryoten begint met een startcodon (AUG) op het mRNA. Het startcodon correspondeert met een speciaal tRNA dat altijd methionine als aminozuur heeft (initiator-tRNA). Dit initiator-tRNA wordt gekoppeld aan de P-plaats op het kleine ribosoomdeel. Eiwitten die translation initiation factors genoemd worden, binden ook aan dit kleine ribosoomdeel. Dit geheel bindt zich aan het 5’-einde van een mRNA-molecuul en gaat op zoek naar een startcodon. Zodra deze gevonden wordt, laten de translation initiation factors los van het geheel. Hierdoor kan het grote ribosoomdeel aan het kleine deel binden. Het ribosoom is nu compleet en de synthese van het eiwit kan beginnen. Het ribosoom schuift over het mRNA en bindt steeds een anticodon van het tRNA met het complementaire codon op het mRNA. De aminozuren worden aaneengekoppeld tot een polypeptideketen. De keten laat los van het ribosoom wanneer een stopcodon bereikt wordt (UAA, UAG of UGA). Er bindt dan een releasefactor aan het stopcodon op het mRNA, waardoor de ribosoomdelen het mRNA en elkaar loslaten en het tRNA de polypeptideketen loslaat.

Een ribozyme is een RNA-molecuul dat een chemische reactie kan katalyseren. Het stap voor stap aan elkaar vastmaken van aminozuren om een polypeptideketen te vormen, wordt gekatalyseerd door een rRNA-molecuul in de ribosomale subunit (het ribosoom is dus een voorbeeld van een ribozyme) van een ribosoom. Een mRNA-streng is meestal gebonden aan meerdere ribosomen tegelijkertijd. Zo’n groep ribosomen wordt ook wel een polyribosoom of polysoom genoemd. De concentratie van een bepaald eiwit is afhankelijk van de aanmaak en afbraak van dit eiwit. De afbraak van eiwitten is dus een manier om de hoeveelheid eiwitten te reguleren. Proteasen zijn enzymen die eiwitten afbreken in kleine peptiden en later in aminozuren. Proteasomen bevatten een centrale cilinder opgebouwd uit proteasen, waarvan de actieve centra naar binnen wijzen. Aan beide einden van de cilinder zit een groot eiwitcomplex dat bestaat uit minstens 10 verschillende eiwitsubunits. Ze kunnen aan eiwitten binden en met behulp van ATP-hydrolyse breken ze eiwitten af. Bepaalde enzymen, ubiquitin genaamd, kunnen eiwitten die afgebroken moeten worden, markeren, zodat proteasomen deze eiwitten kunnen herkennen.

Hoe worden genen en cellen gemanipuleerd? - Chapter 10

Hoe worden cellen geïsoleerd en gekweekt?

Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt, om een bepaald type cel van andere cellen in het lichaam te onderscheiden. Als cellen deel uitmaken van een compact weefsel, en dus dicht op elkaar gelegen zijn, moeten ze eerst van elkaar worden losgemaakt. Om cellen van elkaar los te maken, wordt er veelal gebruikt gemaakt van proteolytische enzymen. Deze proteolytische enzymen kunnen adhesies (de verbindingen) tussen de cellen verbreken. Wanneer deze verbindingen zijn verwijderd, moeten de verschillende soorten cellen in het weefsel van elkaar worden geïsoleerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van fluorescentie. Een fluorescentie-geactiveerde cel kan namelijk makkelijk van andere cellen onderscheiden worden (voornamelijk aan de hand van de kleuring). Geïsoleerde cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor biochemische analyses of voor het kweken van cellen.

Veel dierlijke- en plantencellen overleven en prolifereren alleen in kweken die veel voedingsstoffen en eiwitten (met groeifactoren) bezitten. Experimenten die worden uitgevoerd met gekweekte cellen wordt in vitro genoemd (in vitro betekend in glas). Experimenten met intacte organismes wordt in vivo genoemd (in vivo betekend ‘’in de levenden’’).

De meeste cellen van vertebrale houden op met prolifereren na een x aantal celdelingen. Net zoals bij de menselijke cellen, brengen de meeste vertebrale cellen niet het enzym telomerase tot expressie. Telomerase is een enzym die zorgt dat na elke celdeling, de uiteindes van chromosomen worden vernieuwd, hierdoor is oneindige celdeling mogelijk. Aangezien in menselijke cellen het enzym telomerase niet tot expressie komt, krimpen de chromosomen van deze cellen zich na elke celdeling. Wanneer er een dusdanige hoeveelheid informatie verloren is (die zich bevindt op de chromosomen), stopt de celdeling en/of kunnen deze cellen zich ontwikkelen tot kankercellen.

Een van de meest bijzondere cellen zijn de menselijke embryonale stamcellen. Deze stamcellen zijn namelijk ongedifferentieerd, en kunnen bijdragen aan het bestaan van elk type menselijk weefsel.

Hoe worden DNA moleculen geanalyseerd?

Door recombinant DNA-technologie is het mogelijk om uit duizenden genen die een cel bevat, een enkel gen te selecteren en van dit gen de exacte moleculaire structuur te bepalen. Een belangrijk element van recombinant DNA-technologie is het vermogen om een groot DNA-molecuul in verschillende DNA fragmenten te knippen (met behulp van restrictie nucleases). Restrictie nucleases knipt als het ware de dubbele helix van het DNA kapot, waaruit het DNA uiteenvalt. Het grootste deel van de restrictie nucleases katalyseren de hydrolyse van een fosfaat-diester verbinding in een nucleïnezuur. De restrictie nucleases die worden gebruikt bij recombinant DNA-technologie komen voornamelijk uit bacteriën. Nadat een restrictie nuclease een groot DNA-molecuul heeft gesplitst tot kleinere stukjes DNA-fragmenten, worden deze DNA-fragmenten in de meeste gevallen van elkaar gescheiden. Deze DNA-fragmenten kunnen van elkaar gescheiden worden met behulp van gel-elektroforese. Gel-elektroforese scheidt de DNA-fragmenten op basis van de lengte van deze fragmenten. Wanneer er een elektrische spanning over de gelplaat komt, verplaatsen de DNA-fragmenten zich naar de positieve elektroden van de gelplaat. DNA is namelijk negatief geladen. Hoe groter het DNA-fragment, des te langzamer dit fragment zich verplaatst naar de kant van de elektrode. Na een aantal uur kun je dus de DNA-fragmenten van elkaar scheiden aan de hand van de grootte. Het isoleren van deze DNA-fragmenten van de gelplaat is erg eenvoudig, men kan namelijk gewoon een klein stuk van de gel wegsnijden.

Momenteel zijn er verschillende technieken beschikbaar die snel een nucleotidensequentie van een stuk geïsoleerd DNA-fragment kunnen bepalen. In 1970 was voor het eerst een methode ontwikkeld waarmee de nucleotidensequentie van elk geïsoleerd DNA-fragment eenvoudig en snel kan worden bepaald. Deze technieken hebben het mogelijk gemaakt om volledige nucleotidensequenties van genomen te bepalen. Dit kan zowel bij eencellige organismen (onder andere bacteriën en gisten) als bij meerdere complexe organismen.

Er zijn verschillende mogelijkheden voor het sequensen van DNA. De enzymatische- en de dideoxy-methode zijn de meest gebruikte technieken om het DNA te sequensen. Het proces om de genoomsequentie te lokaliseren en te interpreteren noemt men annotatie. Identificeren van genen is het makkelijkste wanneer de DNA-sequentie afkomstig is uit een eenvoudig genoom. Met een eenvoudig genoom bedoelt men een genoom dat geen/nauwelijks intronen en ander niet-coderend DNA bevat.

Nucleinezuurhybridisatie

DNA is opgebouwd uit twee dubbele strengen DNA, het heeft dus een vorm van een dubbele helix. De twee strengen worden bij elkaar gehouden door zwakke waterstofbruggen. Deze waterstofbruggen kunnen verbroken worden bij een temperatuur van 90 graden Celsius en/of bij extreme pH waarden. Wanneer de twee strengen op deze manier van elkaar worden verbroken (door te verhitten of door het DNA bloot te stellen aan extreme pH-waarden), blijven de covalente bindingen tussen de nucleotiden intact. Wanneer deze processen langzaam worden omgekeerd (dus het DNA weer langzaam aan laten afkoelen en/of door de pH-waarden weer op neutraal brengen), kunnen de twee complementaire DNA strengen weer gemakkelijk een dubbele helix vormen. Deze ‘omgekeerde’ processen worden hybridisatie of renaturatie genoemd. Bij deze processen worden de verbindingen van complementaire waterstofbruggen hersteld.

Nucleinezuurhybridisatie is in staat om elke DNA- of RNA-sequentie in nucleïnezuur-fragmenten op te sporen. Dit is mogelijk, doordat een enkele streng DNA of RNA alleen in staat is om een dubbele helix te vormen met een complementaire nucleotidesequentie. Enkelstrengs DNA dat gelabeld is met fluorescente kleurstoffen, worden bij hybridisatiereacties gebruikt als probes. Nucleinezuurhybridisatie kan gebruikt worden om de exacte locatie van genen in chromosomen vast te stellen. Daarnaast kan het de locatie van RNA in cellen en weefsels vaststellen.

DNA hybridisatie maakt het diagnosticeren van genetische ziekten mogelijk

Wanneer men bij hybridisatie gezocht moet worden naar een bepaalde nucleotidesequentie, is voor deze zoektocht een stukje nucleotidezuur nodig (om mee te zoeken naar de sequentie). Het stukje nucleotidezuur waarmee gezocht wordt, wordt een probe genoemd. Deze DNA-probe is een enkelstrengs DNA-molecuul. Het wordt dus gebruikt om tijdens hybridisatiereacties een nucleinezuurmolecuul te vinden die opgebouwd is uit dezelfde complementaire sequentie. In het verleden konden wetenschappers alleen probes gebruiken die afkomstig waren uit natuurlijke bronnen. Tegenwoordig kan men verschillende sequenties van DNA-strengen maken met behulp van chemische reacties. Deze chemische (niet-enzymatische) reacties worden gemaakt in laboratoria. DNA-probes worden in verschillende situaties gebruikt, maar de belangrijkste functie is tegenwoorden de identificatie van dragers van genetische ziekten. Meer dan 3000 verschillende genetische ziekten die bij mensen voorkomen, worden veroorzaakt door mutaties in enkele genen. Een bekend voorbeeld is sikkelcelanemie. Bij sommige genetische ziekten is het momenteel mogelijk om vroeg tijdens de zwangerschap de ziekte op te sporen. Men identificeert dan foetussen die twee kopieën van het defecte gen hebben (en zo dus een bepaalde genetische ziekte hebben). Een consequentie van deze opsporing kan het vroegtijdig beëindigen van een zwangerschap betekenen. Southern blotting is een van de meest gebruikte laboratoriumprocedure die wordt gebruikt om DNA te hybridiseren.

Dezelfde technieken kunnen ook worden gebruikt om de gevoeligheid van een individu om een bepaalde ziekte te krijgen vast te stellen. De technieken zijn namelijk in stat om individuen te identificeren die abnormale kopieën hebben geërfd van een DNA-mismatch-reparatiegen. Wanneer het mismatch-reparatiegen niet goed werkt, is bijvoorbeeld het risico op het krijgen van bepaalde carcinomen verhoogd.

Hybridisatie en micro-arrays

Een ander belangrijk gebruik van nucleïnezuurhybridisatie is om voor een populatie cellen vast te stellen welke genen precies in het mRNA worden getranscribeerd (‘worden vertaald’) en welke genen niet in het mRNA worden overgenomen (transcriptioneel stil zijn).
DNA micro-arrays hebben ervoor gezorgd dat genen tegenwoordig geanalyseerd kunnen worden door duizenden genen tegelijk te monitoren door naar de RNA-producten van deze genen te kijken. Doordat het mogelijk is om duizenden genen tegelijkertijd te onderzoeken, is men in stat om complexe genexpressiepatronen te identificeren en te bestuderen die ten grondslag liggen aan cellulaire fysiologie (bijvoorbeeld reacties op hormonen).

Hoe wordt DNA gekloond?

Met behulp van DNA-kloneringstechnieken kan een bepaalde DNA-sequentie uit miljoenen andere sequenties worden geselecteerd. Vervolgens kan de geselecteerde DNA-sequentie onbeperkt worden geproduceerd. DNA-ligase is in staat om verschillende vormen van DNA aan elkaar te binden. Dus door DNA-ligase is het mogelijk om DNA-fragmenten die niet in natuur voorkomen, in vitro met elkaar te verbinden. Zo is het mogelijk om nieuw DNA-te creëren.

De eerste stap bij het klonen van DNA is om het DNA dat men wilt kloneren toe te voegen in een stukje van een DNA-molecuul dat in staat is tot replicatie (bijvoorbeeld in een plasmide of een viraal genoom). Dit recombinante DNA-molecuul wordt vervolgens in een snel delende gastheercel gebracht (bijvoorbeeld in een bacterie). Het wordt in een snel delende cel ingebracht, aangezien het DNA dan bij elke celdeling wordt gerepliceerd. Vervolgens worden de bacteriën gelyseerd, en het plasmide-DNA wordt geïsoleerd van de rest van de celinhoud. Zo ontstaan er miljoenen kopieën van het oorspronkelijke DNA-fragment.

Het isoleren van menselijke genen bij het klonen van DNA

Alle gekloneerde fragmenten van chromosomaal DNA die het volledige genoom van een organisme bevatten, wordt een genoombibliotheek genoemd. Deze bibliotheek komt vaak tot stand door de klonen van bacteriën, waarbij elke kloon een uniek DNA fragment bij zich draagt. Complementaire DNA (cDNA) bibliotheken bevatten gekloneerde DNA-kopieën van het totale mRNA van een bepaald celtype of van celweefsel. cDNA wordt gemaakt uit mRNA. cDNA verschilt van genomische DNA-klonen, cDNA bevat namelijk alleen eiwit coderende sequenties. Ze missen dus het DNA wat niet coderend is (bijvoorbeeld intronen en start-DNA/promotors). cDNA zijn dus zeer geschikt wanneer men het gekloneerde gen tot expressie wilt brengen, om bijvoorbeeld een eiwit te maken.

De kettingreactie van polymerase

Het klonen van DNA-bibliotheken was vroeger de enige manier om genen te isoleren. Tegenwoordig gebruikt men vooral PCR. PCR staat voor polymerase chain reaction. PCR maakt een snelle werkwijze voor het kloneren mogelijk. PCR wordt vooral toegepast voor organismen waarvan de volledige genoomsequentie bekend is. PCR gebruikt een DNA-polymerase om een DNA-fragment in meerdere replicatierondes te kopiëren. Bij PCR gebruikt men oligonucleotide-primers. Dit brengt een nadeel met zich mee. Oligonucleotide-primers moeten chemisch worden gesynthetiseerd. Hierdoor is het alleen mogelijk om met PCR DNA te klonen waarvan de begin- en eindsequenties bekend zijn. Vervolgens wordt DNA-polymerase gebruikt om zo veel mogelijk kopieën te maken van de DNA-sequenties.

PCR-techniek is toepasbaar bij verschillende situaties:

• PCR is de voorkeursmethode wanneer relatief korte DNA-fragmenten gekloneerd moeten worden.

• PCR is in staat om infecties, veroorzaakt door pathogenen, in een zeer vroeg stadia op te sporen. Doordat korte sequenties die complementair zijn aan het genoom van het pathogeen worden gebruikt als primers, kan men na vele cycli van amplificatie de aanwezigheid of afwezigheid van deze pathogenen vast gesteld worden. Zo kan men bijvoorbeeld pathogenen in bloedmonsters opsporen.

• PCR wordt gebruikt bij forensisch onderzoek. Doordat PCR extreem sensitief is, is het mogelijk om een nihil klein stukje DNA te linken aan een persoon. Dit komt doordat het genoom van elk mens verschilt in DNA-sequentie van het genoom van een ander.

Hoe werkt het manipuleren van DNA?

Door genetische manipulatie is het mogelijk om zeldzame eiwitten te bestuderen. Bacteriën, gisten en zoogdiercellen kunnen worden gemanipuleerd om een bepaald eiwit (van elk organisme) in grote hoeveelheden te synthetiseren. Hierdoor wordt het mogelijk om eiwitten te bestuderen die anders zeldzaam of moeilijk te isoleren zijn.

Er zijn meer dan 10.000 menselijke genen waarvan de functie onbekend is. Aanwijzingen om achter de functie van een bepaald eiwit te komen, is door te onderzoeken wanneer en waar in de cel (of in het organisme) het eiwit tot expressie wordt gebracht. Het bepalen van het patroon en het moment wanneer het gen tot expressie komt, kan worden bepaald door het regulerende gebied van het gen dat wordt onderzocht te verbinden met een reportergen. Men kan namelijk eenvoudig de activiteit van een reportergen bepalen. Een van de meest populaire reporter-eiwitten die tegenwoordig wordt gebruikt, is groen fluorescerend eiwit (GFP), waarvan het volgen van de bewegingen in de cel mogelijk is.

Kunnen dieren genetisch worden veranderd?

De ultieme test om achter de functie van een gemuteerd gen te komen, is om het gemuteerde gen in het genoom van een organisme in te voegen en te zien welk effect het heeft. Organismen waarin een nieuw gen is geïntroduceerd, of in organismen waarvan het genoom op andere manieren is veranderd met behulp van recombinant DNA-technieken, worden transgene organismen genoemd. Verschillende soorten gen veranderingen kunnen worden gemaakt in genetisch gemanipuleerde organismen:

• Gen-vervanging: het normale gen is volledig vervangen door een mutant kopie van het gen. Dit zal informatie verschaffen over de activiteit van het mutant gen en dus kan het effect van kleine en subtiele mutaties worden bepaald.

• Gen-knockout: het normale gen is volledig gedeactiveerd. Dit wordt gebruikt om informatie te verkrijgen over de mogelijke functie van het normale gen in het hele dier.

• Gen-toevoeging: een mutant gen wordt toegevoegd aan het genoom. Zelfs deze wijziging kan nog steeds bruikbare informatie verschaffen wanneer het geïntroduceerde mutant gen de functie van het normale gen opheft.

Er is een andere manier ontdekt om inactieve genen op te sporen, deze techniek wordt RNA-interferentie (RNAi) genoemd. Deze techniek is gebaseerd op het introduceren van een intro in een cel of organisme van een dubbelstrengs RNA-molecuul waarvan de nucleotidesequentie overeenkomt met die van het gen dat geïnactiveerd moet worden. Het RNA-molecuul hybridiseert met het mRNA dat door het doel gen wordt geproduceerd en stuurt de afbraak ervan aan. Kleine fragmenten van dit afgebroken RNA worden vervolgens door de cel gebruikt om meer dubbelstrengs RNA te produceren, en hierdoor wordt het stukje mRNA gedeactiveerd. Omdat deze korte RNA-fragmenten kunnen worden doorgegeven aan cellen van de nakomelingen, kan RNAi erfelijke veranderingen in genexpressie veroorzaken.

Concluderend, gekloneerde genen kunnen permanent worden ingebracht in het genoom van een cel of een organisme door gebruik te maken van genetische manipulatie. Gekloond DNA kan in vitro worden veranderd om mutant genen te creëren die vervolgens opnieuw in een cel of een organisme kunnen worden ingebracht om de gen functie te bestuderen.

Emery's Elements of Medical Genetics van Turnpenny - 13e druk

Translatie

Wat is de cellulaire en moleculaire basis van overerving? - Chapter 2

Mutaties

Mutaties zijn overerfbare veranderingen in het genetische materiaal. Ze zorgen voor evolutie, maar kunnen ook ziektes veroorzaken. Mutaties ontstaan soms door blootstelling aan mutagene stoffen, maar meestal zijn ze spontaan. Somatische mutaties worden niet aan het nageslacht doorgegeven, mutaties aan geslachtsklieren- en/of cellen wel. Mutaties komen veel voor, niet elke is direct schadelijk. Ook bestaat er 'terugmutatie', waarbij mensen die recessief homozygoot zijn voor een ziekte toch ook gezonde cellen hebben.

De meest voorkomende mutatie is substitutie: een nucleotide wordt vervangen door een andere. Als dit om hetzelfde type gaat, dus allebei pyrimidine (C en T) of allebei purine (A en G) heet het een transitie. Als een pyrimidine een purine wordt of andersom heet het een transversie. De transitie van C naar T komt het meest voor, omdat het complex tussen C en G (het CpG-complex) makkelijk muteert. Bij een deletie verdwijnt één of meerdere nucleotiden, bij een insertie komt er één of meerdere nucleotiden bij. Als een deletie of insertie in het coderende deel optreedt kan het hele leesraam veranderen, tenzij het verloren/ nieuwe deel drie nucleotiden bevat. Grote deleties of inserties kunnen ontstaan door verkeerde cross-overs.

Men spreekt van een dynamische mutatie wanneer een zich herhalende sequentie instabiel wordt naarmate deze langer wordt. Deze herhalingen kunnen ontstaan door fouten in cross-overs, zusterchromatiden-uitwisselingen of DNA-polymerase. Omdat drievoudige herhalingen per generatie langer worden, verklaren ze het plotseling opkomen van ziektes in gezonde families. Het langer worden van een dynamische mutatie gedurende generaties wordt anticipatie genoemd. Veel voorkomende ziekten zijn ziekte van Huntington (CAG)n, Fragile X syndroom (CCG)n en myotonische dystrofie (CTG)n en (CCTG)n.

Bij een synonieme of stille mutatie verandert het eiwit niet, bij een niet-synonieme mutatie gebeurt dit wel. Het laatste komt minder vaak voor. Door een niet-synonieme mutatie wordt vaak de functie van het eiwit veranderd, wat tot ziekte of de dood kan leiden. Er zijn drie soorten niet-synonieme mutaties:

• Missense: hierbij wordt een aminozuur in het eiwit veranderd. Soms verandert daarbij ook de structuur van het eiwit, dit heet een niet-conservatieve substitutie. De kwantitatieve functie blijft vaak hetzelfde, maar de kwalitatieve functie (optimale pH, stabiliteit) niet. Als de verandering van aminozuur geen effect op de functie van het eiwit heeft, noemen we het een conservatieve substitutie.

• Nonsense: hierbij leidt de substitutie tot de vorming van een stopcodon. Deze verkorte eiwitten kunnen vaak hun functie niet uitoefenen. Het 'nonsense-mediated decay'-proces breekt mRNA met vervroegde stopcodons af.

• Frameshift: hierbij is een insertie of deletie niet in drievoud en wordt het leesraam veranderd. Meestal komt hierbij ook een vervroegd stopcodon voor.

Mutaties in niet-coderend-DNA zijn alleen schadelijk als ze in een gebied zitten dat genexpressie regelt, zoals mutaties in de promotor, splicinggebieden of andere regulatorische regio’s.

De gevolgen van mutaties zijn verlies of winst van functie. Verlies van de functie resulteert in een hypomorf eiwit als de functie is afgenomen, en een amorf eiwit als de functie compleet verloren is. Vaak zijn deze aandoeningen recessief. Wanneer in een heterozygote status er wel fenotypische effecten zijn wordt dit een haplo-insufficiëntie mutatie genoemd.

Winst van functie kan leiden tot nieuwe functies of overexpressie. Daarbij kunnen verschillende dominante ziektes ontstaan. Bij homozygoten is de ziekte vaak erger dan bij heterozygoten. Bij een dominante negatieve mutatie zorgt het gemuteerde gen dat het gezonde gen geen goed werkend eiwit meer maakt.

Vaak heeft een ziekte meerdere vormen. Door moleculaire genetica zijn fenotypes steeds beter te verklaren. Bepaalde genotypes worden ook aan bepaalde fenotypes gekoppeld. Dit heet genotype-fenotype correlatie. Bij veel ziektes wordt dit gebruikt om te kijken waar patiënten risico voor lopen.

Essential Cell Biology - Alberts, Hopkins - 4e druk

Structuur & Functie van Eiwitten

Wat zijn structuren en functies van proteinen? - Chapter 4

Wat is de structuur van eiwitten?

Chemisch gezien hebben eiwitten een ingewikkelde structuur en erg verfijnde functies. Eiwitten zijn opgebouwd uit een lange keten aminozuren. Er zijn 20 verschillende aminozuren. Aminozuren zijn met elkaar verbonden door middel van een covalente peptidebinding. Eiwitten worden daarom ook wel polypeptiden genoemd. Elk type eiwit heeft zijn eigen aminozuurvolgorde, die bepalend is voor de uiteindelijke vorm van het eiwit.

Een polypeptide bestaat uit een keten van aaneengekoppelde aminozuren. De specifieke zijgroepen van de aminozuren steken uit de keten. Deze zijgroepen kunnen hydrofiel of hydrofoob zijn, negatief of positief geladen of bijvoorbeeld chemisch reactief zijn. De zijgroep bepaalt de specifieke eigenschappen van het aminozuur.

Lange peptideketens zijn erg flexibel en kunnen dus op veel manieren vouwen. De gevouwen structuur van een eiwit wordt in stand gehouden door niet-covalente interacties tussen verschillende delen van de peptideketen (waterstofbruggen, elektrostatische krachten en vanderwaalskrachten). Ook hydrofobe interacties spelen een rol. De hydrofobe zijgroepen van aminozuren draaien zo ver mogelijk van de waterige omgeving af en dus het eiwit in. De hydrofiele zijgroepen draaien juist naar de waterige omgeving toe en vormen waterstofbruggen met water of met elkaar. Elk eiwit creëert op deze manier een eigen driedimensionale structuur. De niet-covalente bindingen zijn over het algemeen zwak, maar door de combinatie van vele niet-covalente bindingen kan toch een stabiele structuur ontstaan.

De driedimensionale structuur van een eiwit wordt dus bepaald door zijn aminozuurvolgorde. Als laatste heeft ook de energietoestand van het eiwit invloed op de conformatie van dat eiwit. Een eiwit zal in die vorm gevouwen worden waarbij de vrije energie het laagst is.

Het denatureren van een eiwit betreft het verkeerd opgevouwen zijn van dat eiwit. Renaturatie betekent dat het eiwit spontaan de juiste conformatie terugkrijgt. Als eiwitten zich verkeerd opvouwen, kan dat schadelijk zijn voor weefsels en cellen.

In een cel komen bepaalde eiwitten, moleculaire chaperones, voor. Moleculaire chaperones helpen gedeeltelijk gevouwen eiwitten verder te vouwen tot de meest gunstige driedimensionale structuur. Zij maken het proces efficiënter en betrouwbaarder.

Wanneer de driedimensionale structuur van verschillende eiwitten met elkaar vergeleken wordt, valt het op dat er twee vouwpatronen vaak voorkomen, de α-helix en de β-sheet. Deze vouwpatronen ontstaan door waterstofbruggen tussen de N-H en C=O groepen van de ruggengraat (zijgroepen zijn hierbij niet betrokken). α-helices zijn rechtsdraaiende of linksdraaiende spiraalvormige eiwitketens (zie afbeelding), waarbij waterstofbruggen tussen aminozuren zorgen voor de spiraalvorm.

Elke NH-groep van de peptideketen is verbonden met de C=O-groep van dezelfde keten, maar dan 4 aminozuren verder. Er zijn totaal 3,6 aminozuren per draai.
De zijgroepen van de aminozuren komen aan de buitenkant van de helix te liggen. Soms draaien meerdere helices in elkaar, er ontstaat dan een stevige structuur. Dit wordt een coiled-coil genoemd.

β-sheets zijn vlakken, bestaande uit ketens van aminozuren die bij elkaar worden gehouden door waterstofbruggen (de bruggen vinden dus plaats tussen de naast elkaar gelegen delen van de keten). De hoofdketen is hierbij vrijwel gestrekt en de zijgroepen bevinden zich zowel aan de binnen- als aan de buitenkant. Er bestaan parallelle β sheets en antiparallelle β-sheets. In de afbeelding is (A) antiparallel en (B) parallel.

De primaire structuur van een eiwit is de aminozuurvolgorde. De secundaire structuur zijn de α-helices en β-sheets. De tertiaire structuur is de driedimensionale vorm van een hele polypeptideketen. Hierbij horen zowel α-helices, als β-sheets, als andere gevormde structuren. Wanneer er meerdere polypeptideketens samen een eiwitcomplex vormen, wordt dit de quaternaire structuur genoemd.

Het eiwitdomein omvat een deel van een polypeptideketen die zich in een stabiele en compacte structuur kan vouwen. Zo’n eiwitdomein heeft vaak een bepaalde functie. Zogenaamde intrinsically disordered sequences zijn stukken polypeptide zonder eiwitdomein, die erg flexibel zijn.

In theorie zijn er oneindig veel verschillende polypeptideketens mogelijk, maar deze komen niet allemaal in cellen voor. Een polypeptide keten die n aminozuren lang is, heeft 20n mogelijke aminozuurvolgordes. Toch zal maar een klein deel van de mogelijke polypeptideketens vormen tot een stabiele driedimensionale structuur. De eiwitten die niet functioneel of stabiel waren, zijn door natuurlijke selectie geëlimineerd.

Eiwitfamilies zijn groepen eiwitten die qua aminozuurvolgorde en driedimensionale structuur op elkaar lijken. Kleine verschillen in structuur zorgen er echter voor dat verschillende ‘familieleden’ verschillende functies hebben.

Sommige eiwitten zijn opgebouwd uit meerdere polypeptideketens. Elke polypeptideketen in zo’n eiwit wordt een subunit genoemd. De interactie tussen de subunits vindt plaats door non-covalente bindingen. Ook kunnen verschillende eiwitten aan elkaar gekoppeld worden. Virussen en ribosomen zijn bijvoorbeeld opgebouwd uit één of meerdere soorten eiwitten plus RNA of DNA-moleculen.

Globular proteins zijn eiwitten waarvan de polypeptideketen zich opvouwt, zodat er een compact geheel (soort van bal) ontstaat met een onregelmatig oppervlak. Fibrous proteins zijn eiwitten met een relatief simpele, langwerpige driedimensionale structuur. Deze bevinden zich vaak buiten de cel, waar zij een extracellulaire matrix vormen, die cellen van weefsels aan elkaar helpt te binden. Eiwitten die zich extracellulair bevinden, binden hun polypeptideketens vaak door covalente kruisbindingen aan elkaar. Een zwavelbrug is een voorbeeld van zo’n binding.

Een molecuul dat aan een eiwit gebonden is noemen we een ligand. De binding tussen ligand en eiwit bestaat uit non-covalente bindingen. Om de binding zo sterk mogelijk te maken, moet het contactoppervlak tussen ligand en eiwit zo groot mogelijk zijn. De ligand en het eiwit moeten dus precies op elkaar passen. De plaats waar de ligand en het eiwit binden, wordt de bindingsite genoemd.

Enzymen zijn eiwitten die de chemische reacties die in de cel plaatsvinden katalyseren. Een ligand wordt bij een enzym ook wel substraat genoemd. Deze substraten zetten de enzymen om in een specifiek product. Enzymen versnellen reacties door het verlagen de activeringsenergie. Zij worden hierbij zelf niet verbruikt of veranderd. Elk enzym is specifiek voor een bepaald substraat en een bepaalde reactie, maar ook voor een bepaald product.

Enzymen kunnen op drie manieren reacties mogelijk maken:

• Door de ladingsverdelingen in het substraat te veranderen;

• Door in het substraat bepaalde hoeken te veranderen;

• Door substraten die met elkaar reageren op een specifieke manier bij elkaar te brengen.

Eiwitten als hemoglobine kunnen moleculen die geen eiwit zijn, gebruiken om functioneel te zijn. Deze kleine niet-eiwitmoleculen worden dan een onderdeel van het eiwit. Een antilichaam in het bloed jaagt op antigenen. Door specifieke binding van een antilichaam aan een antigeen kunnen deze schadelijke antigenen onwerkzaam worden gemaakt. De werking van verscheidene medicijnen berust in het blokkeren van enzymen.

Hoe werkt de regulatie van eiwitten?

De expressie van eiwitten kan op verschillende niveaus geregeld worden. Ten eerste kan de cel beheren welk eiwit wordt gesynthetiseerd door te reguleren welke genen tot expressie komen. Ook kan de cel reguleren hoe sterk een eiwit wordt afgebroken. Door deze twee processen kan de cel de concentratie van een bepaald eiwit reguleren. Daarnaast kan de expressie van een eiwit geregeld worden door het eiwit aan of uit te zetten. Het aan- of uitzetten van een eiwit kan op verschillende manieren.

De activiteit van eiwitten wordt vaak geregeld door de binding van andere moleculen. Hiervoor heeft het enzym twee bindingssites: één voor het substraat en één voor het regulerende molecuul. Binding van een regulerend molecuul zorgt voor een vormverandering van het eiwit, waardoor het actief of juist inactief wordt. De meeste enzymen zijn allosterische eiwitten. Een allosterisch eiwit is een eiwit dat twee of meer verschillende vormen aan kan nemen, waardoor de activiteit van het eiwit kan verschillen.

Een van de meest voorkomende vormen van regulatie van eiwitactiviteit door binding van moleculen die geen substraten zijn, is feedback inhibition: een enzym in het begin van een reactieketen wordt geremd door een product aan het eind van de reactieketen (negatieve terugkoppeling). De binding van de inhibitor aan het enzym veroorzaakt een vormverandering van het actieve centrum, waardoor substraatmoleculen niet meer kunnen binden. Het enzym staat ‘uit’. Er kan ook een positieve terugkoppeling plaatsvinden. Hierbij wordt de enzymactiviteit gestimuleerd door een bepaald product uit de reactieketen.

Een andere manier van enzymregulatie vindt plaats door het binden of het afsplitsen van moleculen. Voorbeelden van zulke processen zijn:

1. Reversible protein phosphorylation: door het binden/afsplitsen van een fosfaatgroep aan de zijketen van het eiwit, wordt het eiwit inactief/actief gemaakt, doordat een fosfaatgroep negatief geladen is en koppeling/afsplitsing kan zorgen voor een grote conformatieverandering binnen het eiwit. Door fosforylering kunnen eiwitten zich echter ook aan elkaar binden via zogenaamde docking sites. Dit proces van fosforylering gebeurt door omzetting van ATP in ADP. Kinase koppelt een fosfaatgroep aan het eiwit, fosfatase koppelt een fosforgroep van het eiwit af. Fosforylering is een vorm van covalente modificatie.

2. GTP-bindende eiwitten: door het binden van GTP door deze eiwitten wordt het eiwit ‘aangezet’. Door de hydrolyse van GTP ontstaat GDP (difosfaat) en een losse fosfaatgroep. Als GDP aan deze eiwitten is gekoppeld, staat het eiwit ‘uit’. Door GDP van het eiwit te vervangen door GTP wordt het eiwit weer actief gemaakt.

Motor proteins zijn eiwitten wiens hoofdfunctie het in beweging brengen van andere moleculen is. Een eiwit kan zich voortbewegen door een serie van vormveranderingen te ondergaan. Wanneer deze veranderingen niet gereguleerd worden zal het eiwit willekeurig bewegen. Om het eiwit vooruit te laten bewegen moet er voor gezorgd worden dat het eiwit niet achteruit kan. Dit gebeurt door de vormveranderingen van het eiwit te koppelen aan de hydrolyse van een ATP-molecuul dat aan het eiwit gebonden is. Om achteruit te kunnen bewegen, zal het eiwit nu een fosfaatgroep moeten binden aan ADP op weer ATP te vormen. Gezien de energie die deze handeling kost, is dit erg onwaarschijnlijk. Protein machines bestaan uit een samenstel van meerdere allosterische eiwitten. Zij kunnen complexe cellulaire functies efficiënt uitoefenen als gevolg van gecoördineerde vormveranderingen.

Voor veel eiwitten is hun enige doel om te binden aan een ander molecuul. Voor andere eiwitten is deze binding slechts een eerste stap voor hun uiteindelijke functionering. Dat is het geval bij enzymen, een belangrijke eiwitklasse. Zij voeren bijna alle noodzakelijke chemische transformaties uit in een cel. Enzymen binden aan een of meer liganden (substraten) en zetten ze om in chemisch gemodificeerde producten. Dit doen ze talloze keren met hoge snelheid, terwijl ze zelf niet veranderen. Er zijn verschillende typen enzymen, deze worden geclassificeerd volgens de chemische reactie die ze katalyseren (zie tabel 4-1, blz. 144).

Een enzym waarvan de werking uitgebreid bestudeerd is, is een lysozym. Een lysozym katalyseert een hydrolysereactie. Hierdoor wordt de binding tussen twee suikergroepen verbroken. Om de reactie te laten verlopen, moet de activeringsenergie overschreden worden. Dan komt het enzym in het spel. Net als andere enzymen heeft een lysozym een bindingsplaats, een active site. Als een polysacharide bindt aan de actieve site, wordt de binding tussen suiker-suiker verbroken. Het lysozym doet drie dingen om de activeringsenergie terug te brengen:

• Het zorgt ervoor dat een van de twee suikergroepen van vorm verandert, waardoor de verbinding makkelijker verbroken wordt.

• Het brengt de binding die verbroken moet worden in de buurt van twee aminozuren met zure zijketens, die reageren met de verstoorde suikergroep waardoor de binding breekt.

• Het zorgt ervoor dat een watermolecuul reageert met het C1 koolstofatoom van het substraat, waardoor de hydrolyse gecompleteerd wordt.

Andere enzymen gebruiken gelijkwaardige mechanismes om de activeringsenergie te verlagen en zo reacties te versnellen De meeste medicijnen werken door de activiteit van een bepaald enzym te blokkeren.

Hoe werkt controle over eiwitten?

De katalyserende activiteiten van enzymen worden vaak gereguleerd door andere moleculen. Duizenden enzymen werken vaak gelijktijdig en in het zelfde gebied. Het is een heel complex systeem en daarom zijn er uitgebreide controles vereist om alle reacties op de juiste wijze te reguleren. Het meest gebruikte controlemechanisme treedt op wanneer een ander molecuul dan het substraat aan de bindingsplaats van het enzym bindt. Als een bepaald product zich begint op te stapelen, bindt het product zelf vaak aan het enzym waardoor verdere omzetting van substraat gelimiteerd wordt Dit wordt feedback inhibition genoemd. Dat is een vorm van negatieve regulering. Er is ook positieve regulering, dan wordt de enzymactiviteit juist gestimuleerd door een ander molecuul.

Een enzym heeft minstens twee verschillende bindingsplaatsen: een voor het substraat en een andere voor regulerende moleculen. Deze twee bindingsplaatsen kunnen op een bepaalde manier communiceren, zodat de katalyserende activiteit beïnvloed kan worden door regulerende moleculen. Dit gebeurt doordat de structuur van een enzym verandert, zodat bijvoorbeeld de bindingsplaats voor het substraat minder toegankelijk is. De meeste eiwitten zijn allosterisch. Dat wil zeggen dat ze twee of meer verschillende conformaties aan kunnen nemen.

Eukaryote cellen gebruiken vooral een methode om eiwitactiviteit te reguleren waarbij fosfaatgroepen binden aan de zijgroep van het aminozuur van het eiwit. De fosfaatgroepen dragen twee negatief ladingen, hierdoor kan er een grote conformationele verandering ontstaan. Dit zorgt weer voor een verandering van liganden aan het eiwit oppervlak. Zo verandert de eiwit activiteit; deze wordt geïnactiveerd. Het eiwit kan weer worden geactiveerd door enzymen. Deze omkeerbare eiwitfosforylatie reguleert de activiteit van veel verschillende eiwitten. Deze fosfaatgroep komt van een gehydrolyseerd ATP-molecuul; de reactie kost dus energie.