Samenvatting Molecular Biology of the Cell (Alberts et al)

Deze samenvatting bij Molecular Biology of the Cell (Alberts et al) bevat hoofdstuk 1 t/m 7 + 15 en is geschreven in 2014. Inclusief begrippenlijst per hoofdstuk.

1. Cellen en genomen

De algemene kenmerken van de cellen op aarde

Leven wordt onder andere gedefinieerd met het begrip erfelijkheid: de ouder geeft informatie door aan de nakomelingen. Het merendeel van de levende organismen zijn eenvoudige, enkele cellen, maar er zijn ook multicellulaire cellen. Deze cellen hebben speciale functies en communiceren ook met elkaar. Toch begint alles bij een enkele cel. De basis van erfelijkheid is de chemische code in het DNA en wordt aangegeven door vier basen (A, T, C en G). Deze informatie wordt gelezen, gekopieerd en vertaald door de cel in een organisme. Deze letters kunnen ook gelezen worden door wetenschappers, zodat de erfelijke informatie duidelijk wordt. De basen zitten aan een suikergroep en de suikergroep zit aan een fosfaatgroep (nucleotide). DNA is dubbelstrengs, dus complementaire basen zitten vast aan elkaar en tegenover elkaar. De naast elkaar gelegen fosfaatgroepen vormen een polymeer ketting. DNA wordt gekopieerd, DNA replicatie, door het opbreken van de twee strengen, waarna de complementaire base kan hechten aan de template (templated polymerization).

DNA moet niet alleen gekopieerd worden, maar ook geuit worden. Deze rol wordt uitgevoerd door twee andere monomeren: ‘ribonucleic acid’ (RNA) en eiwitten. Het RNA is een gekopieerd stuk DNA dat vervolgens vertaald wordt in eiwitten. RNA verschilt van DNA in twee opzichten: 1) RNA bevat een ribose suikergroep in plaats van een deoxyribose suikergroep en 2) RNA bevat een U in plaats van een T. Daarnaast zijn er verschillende soorten RNA. Een vorm van RNA is messenger RNA dat de informatie van de cel uit de celkern transporteert naar het gebied waar het geuit kan worden. De verschillende soorten RNA hebben ook verschillende vormen door hun flexibele fosfaat- en suikergroepen. Hierdoor kunnen ze ook bindingen met zichzelf maken (GGGG met CCCC).

Aminozuren zijn de monomeren van eiwitten en daar zijn er twintig van. De gevormde polypeptides vouwen zichzelf in een driedimensionale positie met een actieve bindingsplaats. De eiwitten, samen met specifieke moleculen, kunnen reacties katalyseren; dit zijn enzymen. Hierdoor kunnen chemische reacties in de cel sneller plaatsvinden.

Het vertalen van aminozuren gaat met behulp van codons (drie basen achter elkaar; triplet). Er zijn meerdere codons die voor dezelfde eiwitten coderen. De code wordt gelezen door transfer RNA op specifieke bindingsplaatsen. Er zijn twee bindingsplaatsen: 1) tRNA bindt aan een specifiek aminozuur en 2) de andere kant bindt aan het antidocon. De codon wordt gelezen door ribosomale RNA (rRNA), waarna een ketting van aminozuren ontstaat.

Een gen codeert voor een eiwit. RNA moleculen kunnen deze genen op verschillende manieren lezen, maar soms niet helemaal, waardoor er alternatieve versies van eiwitten ontstaan. Genen coderen ook voor RNA. De expressie van individuele genen wordt gereguleerd door de hoeveelheid dat nodig is op dat moment. De regulerende segmenten zitten tussen de eiwit segmenten. Het genoom codeert niet alleen voor DNA, maar reguleert dit ook.

Leven heeft energie uit de omgeving nodig om voort te leven. Deze energie wordt uit de omgeving gehaald om de juiste bindingen en kopieën te maken. Alle cellen functioneren hetzelfde met dezelfde basis (RNA, DNA, eiwitten, of kleine eiwitten zoals simpele suikers, nucleotiden en aminozuren). Daarnaast is de belangrijkste stof adenosine triphosphate (ATP). Ook zijn alle cellen omringd door een membraan. Hier kunnen voedingsstoffen doorheen en afval door afgevoerd worden. Dit membraan is amfilisch: een deel is hydrofoob (waterafstotend) en het andere deel is hydrofylisch (waterliefhebbend). De hydrofobische kant heeft een hydrocarbon staart (CH2-CH2-CH2). Daarnaast kan het membraan zich vouwen op een manier dat de cel nodig heeft. Ook zijn er membraan transport eiwitten die afval weggooien. Deze zijn zelfs bijna hetzelfde in hele verschillende organismen. Dit houdt in dat deze eiwitten al zeer oud zijn. De katalytische eiwitten in de cel bepalen de chemie en wat er gebeurt met de binnenkomende moleculen.

Een levende cel kan bestaan met minder dan 500 genen. Een voorbeeld hiervan is het Mycoplasma genitalium en bevat 480 genen. Het leeft als een parasiet, maar moet nog wel zijn eigen DNA, RNA en eiwitten maken voor de basisproducten van erfelijkheid.

De diversiteit van genomen en de boom des levens

Cellen krijgen energie uit verschillende bronnen met vrije energie. Organotrofe organismen ontvangen energie uit chemische omzettingen van organische stoffen (bijvoorbeeld: mensen en bacteriën). Andere organismen die hun energie uit de niet-levende wereld halen, vallen in twee klassen: 1) fototroof (bacteriën en algen) en 2) lithotroof (microscopische organismen in rotsen, diepzee en aardkost). De eerste haalt zijn energie uit zonlicht en de tweede klasse haalt zijn energie uit rotsen. Organotrofen overleven niet zonder deze twee klassen. Sommige lithotrofen krijgen energie van aerobische reacties met zuurstof uit de omgeving. Er zijn ook anaeroben in zuurstofarme omgevingen. Deze leven waarschijnlijk al lang, al voordat er zuurstof was. Een andere vorm van vrije energie zijn de hydrothermale openingen in de diepzee. Deze bevatten vele chemicaliën en warmte waar organismen van leven.

DNA, RNA en eiwitten bestaan uit water, koolstof, stikstof, zuurstof, sulfaat en fosfor. In de atmosfeer zit N₂ en CO₂, maar dit is onbruikbaar voor organismen. Andere organismen zetten dit om zodat ze dit wel kunnen gebruiken. Planten zetten bijvoorbeeld CO₂ om in O₂, maar hebben bacteriën nodig voor stikstof.

Organismen kunnen ingedeeld worden in twee klassen: 1) eukaryoten en 2) prokaryoten. De eukaryoten houden hun DNA in een apart membraan: de celkern. Eukaryoten zijn planten, schimmels en dieren. Prokaryoten zijn bacteriën en archaea. Bacteriën bevatten een sterke celwand. Daarin zit alles wat de bacterie nodig heeft om te leven. Daarnaast zijn prokaryoten heel divers, kunnen bijna overal op leven en verwerken energie met of zonder bijproducten.

De classificatie van organismen kan op basis van uiterlijk, maar wanneer organismen veel op elkaar lijken, wordt dit lastiger. Daarom gebruiken wetenschappers tegenwoordig het genoom om evolutionaire relaties te ontdekken. De boom des levens, met alle organismen op de wereld, bestaat uit drie domeinen: 1) bacteriën, 2) archaea en 3) eukaryoten. Archaea leven op plekken waar mensen niet komen zoals de diepzee of zure, hete bronnen. Onder de microscoop zijn ze moeilijk te onderscheiden van bacteriën, maar lijken qua DNA meer eukaryoten op het gebied van replicatie, transcriptie en translatie.

Random fouten kunnen de nucleotide sequentie veranderen (mutaties). De klasse één veranderingen zullen behouden blijven, omdat het organisme zich voortplant. De klasse twee veranderingen, selectieve neutrale veranderingen, blijven in het organisme op basis van kans. Door mutatie en natuurlijke selectie veranderen organismen dus. Er zijn verschillen in de snelheid qua veranderingen. Een gen dat voor niks codeert, kan sneller en vrijer veranderen. Een gen dat codeert voor een belangrijk eiwit, moet juist blijven (zeer behouden). Als men genomen vergelijkt, wordt er naar zeer behouden genen gekeken.

Bacteriën kunnen snel evolueren, omdat ze snel delen, weinig ruimte innemen en weinig DNA hebben (1000-6000 genen). De genen worden vergeleken met voorouderlijke en levende organismen om een plekje te vinden in de boom des levens. DNA is nooit nieuw, want het komt van eerdere organismen. Innovatie kan op vier manieren ontstaan:

1.      Intragene mutatie verandert het bestaande gen. Dit gebeurt vaak tijdens de replicatie.

2.      Genduplicatie vindt plaats wanneer een gen verdubbelt wordt. Deze twee dezelfde genen kunnen op aparte wijzen evolueren.

3.      DNA segment schuiven: een stukje gen komt ergens anders terecht door het opbreken en weer aan het elkaar binden van genen.

4.      Horizontale (intercellulaire) transfer: een gen verplaatst zich naar een ander genoom of cel. De verticale transfer is van ouders naar nakomelingen.

Door genduplicaties kunnen ‘families’ ontstaan van genen die zeer veel op elkaar lijken in een enkele cel. Dit moet gescheiden blijven van vergelijkingen tussen organismen, omdat anders soortenvergelijkingen niet goed verlopen. Genen die gerelateerd zijn door afkomst, heten homologen. Dit kan gezien worden als een gemeenschappelijke voorouderlijke vorm. Hierin zijn twee klassen te onderscheiden: 1) ortholoog en 2) paraloog. Genen die hetzelfde zijn in twee verschillende soorten, gelijk aan het gen van de gemeenschappelijke voorouder, wordt ortholoog genoemd. Paraloge genen zijn duplicatiegenen die apart zijn geëvolueerd qua functie. Deze stammen dus af van een enkel gen binnen dezelfde soort, terwijl orthologie voorkomt tussen verschillende soorten.

Virussen, of bacteriofagen, laten verticale transfer zien. Deze virussen gebruiken vectoren voor gentransportatie. Dit zijn kleine pakketjes met genetisch materiaal naar een gastheercel, waarna daar het replicatiecentrum wordt gebruikt voor de voortplanting van dat virus. De gastheercel kan dood gaan, maar ook voortleven met een stukje virus (plasmide). Op deze manier wordt het penicilline resistente gen doorgegeven. Prokaryoten kunnen ook DNA opnemen uit hun omgeving, waardoor nieuwe soorten kunnen ontstaan.

Horizontale veranderingen in de genetische informatie van een bacterie/archaea zijn heel belangrijke geweest voor hun evolutie, omdat ze geen seks hebben. Seks brengt namelijk een grote diversiteit in dieren tot stand en is een horizontale transfer. De nakomelingen van ouders lijken het meest op de ouders dan op andere individuen uit die soort.

De functie van een gen kan vaak bepaald worden door zijn sequentie. Deze kan vervolgens vergeleken worden met andere genen om de verwantschap te bepalen. Daarnaast kan de functie bepaald worden door sequenties te vergelijken met al reeds bekende sequenties en functies. Als de verwantschap bepaald is, kan het organisme een plekje krijgen in de boom des levens. Hierbij zijn er een aantal problemen. Ten eerste kunnen organismen voorouderlijk DNA verloren hebben, ten tweede kunnen organismen DNA op een verticale manier verkregen hebben en ten derde zijn de genen al zeer oud en sowieso in de 2-3 miljoen jaar veranderd. Op dit moment wordt de boom des levens ingedeeld met ultrabehouden genen. Toch is er nog veel meer duidelijkheid nodig over de genomen van organismen.

Mutaties kunnen de functies van genen onthullen. Dit is het doel van genetica: het vindt of maakt een mutatie en kijkt vervolgens hoe dit resulteert in het uiterlijk of gedrag van dat organisme. Biochemie kijkt naar de moleculen en chemische activiteit van een organisme. Als deze twee studies worden samengevoegd, kan er een hoop duidelijk worden over de functie van dat stukje gen. Daarvoor is er kennis nodig van het hele genoom en het organisme. Hiervoor worden modelorganismen gebruikt die makkelijk in gebruik zijn voor onderzoek. Een voorbeeld hiervan is de Escherichia coli. Dit is een bacterie en kan snel gekweekt worden. Uit de E. coli is duidelijk geworden hoe sommige fundamentele mechanismen, zoals replicatie, werken. Deze zijn zo oud dat ze ongeveer hetzelfde zijn als bij de mens. Met model organismen kunnen we ook onszelf dus gaan begrijpen.

Genetische informatie in eukaryoten

Eukaryoten zijn groter en complexer dan prokaryoten. Het DNA zweeft niet los rond zoals bij prokaryoten, maar zit in een aparte celkern met een dubbel membraan. Ze zijn tien keer zo groot en hebben een cytoskelet voor mechanische kracht, vorm en beweging. Doordat het membraan zachter (protozoa) is dan prokaryoten, kunnen ze andere cellen opnemen (fagocytose). Ze kunnen begonnen zijn als jagers, ze leefden dan op andere cellen. Het jagers-idee is ook een verklaring voor de mitochondria (energiefabrieken). Deze hebben eigen DNA, hebben eigen ribosomen, eigen tRNA en lijken op bacteriën. Ze zijn opgenomen zodat de cel energie kreeg en zij een plekje om te leven. Chloroplasten in planten lijken op mitochondria en laten fotosynthese plaatsvinden voor de energie. Fungi hebben ook mitochondria, maar geen protozoa en dus een harde celwand. Hierdoor kunnen ze niet bewegen en moeten ze leven op resten van andere organismen.

DNA van de mitochondria en chloroplasten bestaat uit DNA voor de energie, maar bevatten ook genen voor andere onderdelen. Deze zijn niet verloren gaan, maar in het genoom van de gastheercel terecht gekomen. Hierdoor is het genoom van de eukaryoten hybride. Daarnaast bevat het DNA van een mens met eukaryote cellen heel veel niet-coderend DNA. Men denkt dat er veel DNA is, omdat jagers groot moeten zijn, door parasiete mobiele elementen die alles opeisen of omdat het DNA zo vaak verdubbeld is. Het niet-coderende DNA bevat genen dat naastgelegen genen reguleert.

Alle cellen in een organisme hebben hetzelfde DNA, maar toch wordt de ene cel een zenuwcel en de andere een botcel. Dit wordt geregeld door de sequentie instructies uit de omgeving. Dit zijn vaak gen regulerende eiwitten die direct of indirect genen aansporen of stoppen.

Sommige eukaryoten leven solitair, zoals de protisten. Dit zijn zeer diverse klassen van organismen. Tekeningen van voorbeelden zijn te zien op pagina 33, figuur 1-41.

Gist (Saccharomyces cerevisiae) is een makkelijk, minimaal en eencellig model eukaryoot voor de wetenschap. Het heeft een harde celwand, is relatief immobiel en bevat mitochondria. Gist kan zichzelf delen als voortplanting, maar ook zichzelf seksueel voortplanten. Hierbij voegen twee gistcellen zich samen, worden diploïde en ondergaan meiose. De eukaryotische cel divisie is duidelijk geworden door dit organisme. Het mRNA wordt gebruikt om de expressie van alle genen van een organisme tegelijk te zien. Hier wordt een mRNA stuk vergeleken met een gemuteerd mRNA stuk dat een bepaald gen mist. Het vergelijken en verdere verwerkingen van DNA wordt gedaan met behulp van de computer, wiskunde en kwantitatieve informatie (de juiste waarden gebruiken, voor de juiste voorspellingen).

Planten zijn niet lang geleden pas gaan evolueren. Hierdoor zijn deze groepen organismen nog zeer gelijk aan elkaar. De Arabidopsis thaliana is het modelorganisme dat voor de plantengroep veel is gebruikt, produceert duizend nakomelingen in acht à tien weken en is elf keer groter dan gist. Dieren hebben geholpen om multicellulaire organismen te gebruiken. Deze dieren zijn de worm Caenorhabditis elegans, de vlieg Drosophila melanogaster, de muis Mus musculus en de mens Homo sapiens. De C. elegans kan bevroren worden en in die staat gehouden worden, heeft 97 miljoen nucleotiden en heeft geholpen bij het begrijpen van celdeling en celdood. De Drosophila heeft laten zien hoe mutaties in genen resulteren in fenotypen. Het is eigenlijk een insect, maar handig in gebruik omdat het vliegje zo klein is, snel voortplant en veel nakomelingen heeft. Daarnaast is het vliegje ook handig, omdat het ‘maar’ 170 miljoen nucleotiden heeft. Het gewervelde dier zit vol met paralogen, clusterduplicaties en volgens een hypothese is zelfs het hele genoom een keer verdubbeld (vier genen). Bij gewervelden is de herkomst moeilijk te traceren, want er zijn vele duplicaties en deze zijn allemaal een andere weg op gegaan. Een voorbeeld hiervan is de X. ruwenzoriensis: deze heeft 108 chromosomen door duplicatie in tegenstelling tot zijn haploïde soortgenoot met 36 chromosomen.

Er zijn genen die verwisselbaar zijn qua functies. Dit wordt genetische overtolligheid genoemd en is voor wetenschappers heel vervelend. Het houdt de identificatie van genen tegen. Ook al nemen genen soms nieuwe rollen op zich, er zal altijd iets van het origineel blijven zitten. Bij de Drosophila vindt er relatief weinig duplicatie plaats. Op dit moment is de muis een van de best gebruikte dieren in genetisch onderzoek. Het genoom van de mens is ook in kaart gebracht, waardoor het opsporen van mutaties sneller gaat, maar het blijft een heel groot genoom met drie biljoen nucleotiden. Er wordt gekeken naar ziektes, hoe die ontstaan en hoe dit verholpen kan worden. Gewassen worden zo gemanipuleerd dat ze meer en beter produceren en bacteriën worden voor ons eigen gebruik gekweekt en gemanipuleerd.

2. Celchemie en biosynthese

De chemie is van belang in de biologie vanwege drie punten: 1) het leeft op koolstofverbindingen (organische chemie), 2) cellen bestaan voor 70% aan water en de meeste reacties reageren met of in water en 3) celchemie is zeer complex.

De chemische samenstelling van een cel

Materie bestaat uit combinaties van elementen. De kleinste elementen zijn atomen en deze kunnen groepen vormen (moleculen). Het atomische gewicht, of het moleculaire gewicht, is de relatieve massa ten opzichte van een watermolecuul. Deze massa wordt aangegeven in Dalton. De massa staat voor en boven het molecuul (voorbeeld ¹²C). Het getal van Avogrado is de hoeveelheid van individuele moleculen of atomen (6 x 10²³ is een mol). Een mol is het aantal gram van een substantie. De belangrijkste moleculen voor een organisme zijn waterstof (H), stikstof (N), zuurstof (O) en koolstof (C).

De elektronen bepalen de binding, want de pro- en neutronen zitten dicht tegen elkaar aan in de kern. De elektronen zitten in verschillende elektron schelpen om de kern heen. Schelp 1 (dichtst bij de kern) bevat er maximaal twee, schelpen 2 en 3 bevatten er maximaal acht en schelpen 4 en 5 maximaal 18. Wanneer de schelpen vol zitten, dan is het atoom stabiel en anders niet. Hierdoor kan er interactie, uitwisseling van elektronen, plaatsvinden met andere atomen en chemische bindingen gevormd worden. Dit kan een ionische binding (doneren van elektronen) zijn, een covalente binding (twee atomen delen een elektron) of een polaire covalente binding (een molecuul is meer elektronegatief; voorbeeld waterstof). Het aantal elektronen wat een atoom moet verkrijgen of verliezen om de buitenschelp te vullen, heet valentie. Er zijn verschillen in het aantal elektronen in de buitenste schelp en op basis hiervan is het periodieke systeem gevormd.

Covalente bindingen worden gevormd door het delen van elektronen tussen moleculen. Hierdoor wordt de buitenste schelp gevuld. Wanneer het trekken aan de elektron in balans is, worden de kernen gescheiden door een bepaalde afstand: de bindingslengte. Deze wordt bepaald door de hoeveelheid energie die nodig is om te binding te verbreken. De reacties worden geholpen door katalisten, oftewel enzymen. Het aantal elektronen dat nodig is om de buitenste schelp te vullen, met behulp van een covalente binding, is de covalentie.

Er zijn verschillende typen covalente bindingen:

·         Enkele bindingen: deze atomen delen één paar elektronen.

·         Dubbele bindingen: deze atomen delen meer dan één paar elektronen.

·         Polair: twee atomen worden naar elkaar toegetrokken door hun negatieve en positieve ladingen. Deze zijn belangrijk voor permanente dipolen: moleculen kunnen dan, ondanks de elektrische krachten, communiceren.

Moleculen worden aangegeven met bolletjes en stokjes, maar het is handiger om de ruimte-vullende modellen te gebruiken. In deze modellen worden de elektronen als een jasje om het atoom gemaakt, waarna de van der Waals-radius duidelijk wordt. Dit is wanneer het jasje een niet-gebonden atoom afstoot. Als de elektron weer iets verder weg is, wordt het weer aangetrokken (van der Waals aantrekking).

Een watermolecuul bestaat uit een zuurstof- en twee waterstof atomen. Deze zijn zeer polair, omdat de zuurstof elektronen sterk aantrekt en waterstof heel zwak. Hierdoor kunnen er extra bindingen, waterstofbindingen, gevormd worden met andere watermoleculen (H-O). Deze bindingen zijn zeer zwak. Hydrofiele moleculen (DNA, RNA, suiker, eiwitten) houden van water en hydrofobe moleculen stoten water af.

Een proton is een positief geladen deeltje dat deel is van een atomische kern (bijvoorbeeld H+). Deze kan binden aan een watermolecuul waardoor je een hydronium ion hebt (H₃O⁺). Een substantie dat een proton doneert, heet een zuur. Het tegenovergestelde is een base. Deze accepteren juist protonen (OH^-). Om de zuurgraad aan te geven, wordt de pH-schaal gebruikt. Zuur is wanneer de waarde onder de zeven ligt en basisch wanneer deze waarde boven de zeven, maximaal veertien, ligt. Een alkaline dissocieert in waterige oplossingen om Na⁺ en OH^- ionen te vormen. Het doneren en accepteren gebeurt wanneer het tegenovergestelde in hoge concentraties voorkomt.

Verschillende typen van noncovalente aantrekkingskrachten, brengen moleculen bij elkaar in cellen:

·         Covalent

·         Noncovalent

o       Ionisch: een elektrostatische aantrekking tussen twee volledig geladen atomen.

o       Hydrogeen (figuur 2-15 op pagina 54): een H-atoom deelt zichzelf met zuurstof of stikstof moleculen. Deze is niet sterk, maar zeker niet in water met andere waterstofmoleculen.

o       van der Waals: de elektronenwolk zal fluctueren, waardoor er een fluctuerend dipool ontstaat. Dit zorgt ervoor dat andere atomen zich ook zo gaan gedragen. Vervolgens ontstaat er een hele zwakke binding die niet minder sterk wordt door water.

·         Hydrofobische kracht is geen binding, maar wel iets wat atomen beïnvloedt. Deze duwt watermoleculen van zich af. 

De belangrijkste stof voor cellen is koolstof. Dit wordt voor heel veel processen gebruikt. Het heeft een covalentie van vier en een atoom met een C behoort tot de organische moleculen. Een chemische groep heeft chemische en fysieke eigenschappen dat het gedrag van een molecuul beïnvloedt. Voorbeeld: methyl (-CH₃), fosfaat (-PO₃²-) en sulfhydryl (-SH).

De kleine organische moleculen zijn opgebouwd uit koolstof onderdelen. Monomeren worden gebruikt om de enorme polymere macromoleculen, eiwitten bijvoorbeeld, te construeren. Er zijn vier grote families van kleine organische moleculen: suikers, vette zuren, aminozuren en nucleotides.

Suiker ((CH₂O)ⁿ; monosaccharides) wordt gevormd door covalente bindingen tussen de drie atomen. Ze kunnen voorkomen in D- en L-vormen. Dit zijn spiegelbeelden van elkaar (optische isomeren). Isomeren hebben dezelfde chemische inhoud, maar de structuur is anders per isomeer. Er vindt in suiker een condensatie reactie plaats, waardoor er twee -OH groepen een binding vormen. Hieruit verdwijnt een watermolecuul. Een watermolecuul wordt juist weer toegevoegd door een hydrolyse reactie. Soms is het moeilijker om een suikermolecuul te lezen dan een DNA sequentie, omdat er bij suiker drie opeenvolgingen kunnen zijn en bij DNA maar een. Glucose wordt omgezet in cellen om energie te winnen (glycogeen in dieren en zetmeel in planten). Ze kunnen ook gebruikt worden voor mechanische support, zoals bij plantenwanden: cellulose en bij mensen het bloedtype.

Een vetzuur bestaat uit een waterkoolstof ketting (hydrofoob en reageert nauwelijks) en een zuurgroep (-COO^-; hydrofiel en zeer reactief). Als een ketting geen dubbele bindingen heeft, dan is deze verzadigd en als deze wel dubbele bindingen heeft dan is het een onverzadigde ketting. Vetzuren worden opgeslagen in cytoplasma in de vorm van triaglycerol moleculen. Uit de ketting kan energie gehaald worden. Triaglycerol of steroïden zijn voorbeelden van een lipide: onoplosbaar in water. De belangrijkste functie van een vetzuur is het vormen van een membraan (figuur 2-22 op pagina 59). Ze bestaan uit fosfolipiden die amfilisch (hydrofoob en hydrofiel) zijn. Een lipide dubbellaag wordt gevormd in water wanneer de hydrofobe staarten naar elkaar toe gericht zijn.

Aminozuren bevatten een alpha-koolstof dat een aminogroep (N-terminus) en een zuurgroep (C-terminus) huishoudt. De belangrijkste functie van aminozuren is het vormen van eiwitten. Een peptidebinding is de binding tussen twee aminozuren. De eiwitten vormen zich tertiair en alleen in L-vormen. De aminozuren hebben allemaal verschillende functies, zoals lading dragen, polair, hydrofiel, et cetera.

Een nucleotide bevat een stikstof gelinkt aan een suikergroep dat weer vast zit aan een fosfaatgroep. De stikstof draagt een base (C, T, U zijn pyrimidines en A en G zijn purines) en is een base. Adenosine trifosfaat (ATP) is een drager van energie en wordt gemaakt door het opbreken van fosforanhydride bindingen (fosfor komt vrij). De belangrijkste functie van een nucleotide is het opslaan van biologische informatie. De nucleotides worden samengebonden door de fosfordi-ester binding. Er zijn twee soorten: ribonucleic acid (RNA) en deoxyribonucleic acid (DNA). RNA is meestal enkelstrengs, terwijl DNA dubbelstrengs is.

Macromoleculen worden opgebouwd uit monomeren en hebben allemaal aparte functies. Vele eiwitten zijn enzymen (katalisten), maar sommige helpen ook om structurele (voorbeeld histon) mechanismen te vormen. Een polymeer groeit door condensatie reacties die monomeren toevoegen. De vorm van een macromolecuul en de binding met andere moleculen wordt geregeld door noncovalente bindingen. De meeste bindingen staan rotatie toe waardoor er conformaties ontstaan. Noncovalente bindingen zorgen dat verschillende delen van een polymeer bepaalde conformaties het liefst aannemen.

Katalisatie en het gebruik van energie door cellen

Normaal gesproken heeft de cel een hogere temperatuur nodig om een reactie te volbrengen, maar deze temperatuur is er niet. Wel zijn er speciale eiwitten, enzymen, die de reactie extra energie geven, katalyseren, om te volbrengen. De ene reactie is vaak het startpunt voor de volgende reactie, substraat. Het metabolisme van de cel wordt geregeld door twee onderdelen: 1) het katalytische onderdeel breekt grote moleculen in kleinere zodat ze gebruikt kunnen worden en 2) het anabolische onderdeel, de biosynthese, gebruikt energie van katalysatie voor de synthese van andere moleculen.

De tweede wet van thermodynamiek stelt dat de chaos in een geïsoleerd systeem alleen maar toeneemt naarmate de tijd verstrijkt. Het is een spontaan proces en om iets geordend te houden, kost dit energie. De hoeveelheid chaos in een systeem wordt uitgedrukt als de entropie. Waar de energie van een cel vandaan komt, is te verklaren door de eerste wet van thermodynamiek. Deze stelt dat de binnenkomende energie dezelfde hoeveelheid moet hebben als de uitgaande energie. Een cel haalt voedsel binnen en neemt daar dezelfde hoeveelheid energie uit. De energieproductie zorgt ervoor dat er orde blijft, in plaats van spontane chaos.

De zon is de energie voor planten en indirect dus ook voor mensen. Met behulp van zonlicht vindt er fotosynthese plaats: elektrochemische energie wordt omgezet in een chemische energie in de cel. Ze gebruiken CO₂, zuurstof, waterstof, stikstof en nitraten op kleine moleculen te maken. Er zijn twee fases: 1) zonlicht wordt opgeslagen en 2) de energiedragers uit stap 1 worden gebruikt bij het koolstof fixatie proces waarbij suiker gemaakt wordt uit CO₂ en H₂O. De formule is:

Zonlicht + CO₂ + H₂O --> suiker + O₂ + hitte energie

Respiratie is wanneer een cel energie haalt uit organische moleculen en daarbij CO₂ en H₂O produceert. De plant neemt dit weer op en zo zijn er ook andere organismen die gebruik maken van elkaars afvalstoffen: biosfeer. Oxidatie is niet alleen het toevoegen van zuurstofmoleculen, maar meer een reactie waarbij elektronen uitgewisseld worden. Oxidatie is het verwijderen van elektronen en reductie is het toevoegen van elektronen. Deze twee processen vinden altijd tegelijkertijd plaats tussen twee moleculen. Wanneer een koolstofatoom een covalente binding aangaat met een atoom dat graag elektronen wil, zullen er vele elektronen gedeeld worden waardoor er een polaire binding ontstaat (oxidatie). De algemene formule is:

A + e- + H+ --> AH

Als er naast de elektron ook een proton meedoet, heet dat hydrogenatie (reductie; C-H bindingen nemen toe) en andersom, een dehydrogenatie (oxidatie; C-H bindingen nemen af).

Een reactie kan een verlies van losse energie opleveren. Deze losse energie komt later aan bod, maar dit is een reactie die bergafwaarts gaat en wordt geprefereerd boven een opwaartse reactie. Een reactie heeft activatie; energie nodig: een extra zet om over een energie barrière te komen zodat de reactie kan beginnen. Dit wordt gedaan met behulp van enzymen die binden aan chemisch passende substraten om chemische reacties te starten. Deze kunnen de activatie energie verlagen (katalist) en bevatten precieze actieve plaatsen waar de substraten passen.

Moleculaire bewegingen zijn zeer snel, moeten substraten precies goed kunnen vinden en zijn te classificeren in drie groepen:

1.      Translationele beweging: de beweging van een molecuul van de ene naar de andere plek.

2.      Vibratie: de snel heen en weer beweging van covalente atomen.

3.      Rotaties.

Een voorbeeld van translationele beweging is diffusie: moleculen verspreiden zich over een bepaald gebied in een bepaalde tijd. Atomen lopen totdat ze ergens tegen aan botsen, waarna ze de andere kant op gaan (random walk).

Cellen groeien doordat ze gebruik maken van bergopwaartse energie. Dit komt door de gekoppelde energie dat bergafwaartse energie produceert om zo de bovenstaande energie, die minder handig is eigenlijk, te produceren. De toename in chaos in het universum wordt aangegeven met vrije energie (G). Het is alleen interessant als er een verandering is in energie (ΔG). Geprefereerde energie reacties hebben een negatieve ΔG. De ongeprefereerde energie, met moeite, heeft een positieve ΔG (aminozuren aan elkaar binden). Deze reacties kunnen alleen plaatsvinden als de energiesom van het hele proces negatief is.

Wanneer er veel van Y is en weinig van X, zal er in een wederkerige reactie (X <--> Y) meer X ontstaan (Y --> X). De ΔG kan bepaald worden uit de volgende reactie:

ΔG = ΔG° + 0,616 ln [X]/[Y] = ΔG° + 1,42 log [X]/[Y]

Hierbij is ΔG° de standaard vrije energie verandering, de ΔG is in kilocaloriën per mol, [X] en [Y] zijn de concentratie, ln is het natuurlijke logaritme, en de constante 0,616 bij een bepaalde gasconstante (R) en temperatuur (T). Wanneer ΔG nul is, is er een chemisch equilibrium. De evenwichtsconstante K is per reactie anders, maar wel uitdrukt in een formule:

K = [X]/[Y]

Hieruit blijkt dat de concentratie van de gebruikte stoffen de vrije energie verandering beïnvloedt. Één kant op bij de wederkerige reactie kost energie, in plaats van dat het energie oplevert. Hiervoor is extra energie nodig om die reactie te laten plaatsvinden.

De energie die vrijkomt tijdens oxidatie, wordt tijdelijk opgeslagen op een uitwisselbare manier door geactiveerde dragers. Deze zijn essentieel voor de biosynthese. Dit worden ook wel eens co-enzymen genoemd. De energie die gedragen wordt is meestal ATP, en soms NADH of NADPH. Als er een positieve reactie plaatsvindt, er komt energie vrij, wordt dat opgeslagen of gebruikt in een reactie die energie nodig heeft, in plaats van dat het omgezet wordt in warmte. Dit wordt gedaan door een gekoppelde reactie. ATP wordt gevormd uit adenosine difosfaat (ADP) waar een fosfaatgroep wordt toegevoegd. Door hydrolyse komt de fosfaatgroep weer los, waarna er energie is. ATP wordt vaak gebruikt om twee moleculen samen te voegen.

NADH (tussenrol in de katabolische systemen van reacties die helpen bij ATP, oxidatie en voedselmoleculen) en NADPH (werkt samen met enzymen die anabolisch reacties katalyseren) worden gebruikt om elektronen te dragen. Zij helpen bij de oxidatie en reductie en als ze een elektron dragen heten ze nicotinamide adenine dinucleotide (NAD⁺) en nicotinamide adenine dinucleotide (NADP⁺). De dragers zonder plusjes zijn gereduceerd. NADPH is een actieve drager bij biosynthetische reacties en draagt een H⁺ uit de omgeving. De extra fosfaatgroep bij NADPH past weer in andere substraten, dan die van NADH. Ze dragen wel gelijkwaardig elektronen.

Co-enzym A wordt gebruikt om een acetylgroep (acetyl CoA) te dragen en wordt gebruikt om twee koolstof atomen in de biosynthese van grotere moleculen bij elkaar te voegen.

Macromoleculen worden gevormd uit monomeren en condensatie reacties. De hydrolyse, het toevoegen van een watermolecuul, breekt de aan elkaar gebonden monomeren weer op.

De herhalende condensatie reacties worden in twee richtingen gemaakt. 1) De hoofd polymerisatie zorgt ervoor dat een condensatie reactie een monomeer aan het hoofd toevoegt, maar bij elke nieuwe monomeer moet de reactiekant van het monomeer opnieuw aangemaakt worden voor een nieuw monomeer. 2) De staart polymerisatie is simpeler en het monomeer gebruikt zijn eigen binding, om zichzelf vast te zetten.

Hoe cellen energie krijgen uit voedsel

Voedsel dat organismen innemen, wordt afgebroken zodat er moleculen zijn die weer opgebouwd kunnen worden naar de behoefte van het organisme. Eiwitten worden aminozuren, polysaccharides worden suiker en vetten veranderen in vetzuren.

Glycolyse zorgt voor de oxidatie van suikers waarvoor geen zuurstof in gasvorm nodig is. Het is een heel oud proces, wat er al was toen er geen zuurstof was in de atmosfeer, waarbij een ketting van zes koolstof atomen in tweeën wordt geknipt (pyruvate; figuur 2-70, pagina 89). Een enzym eindigt met zijn naam op -ase. Ook al is er geen zuurstof, er vindt oxidatie plaats omdat er een elektron mist. De pyruvaten worden in de mitochondria gestopt, waarna er energie geproduceerd wordt. Onder anaerobische omstandigheden worden de pyruvate en de NADH elektronen omgezet in de cytosol. De pyruvate wordt omgezet en uitgescheiden buiten de cel waarna de NADH zijn elektron weg geeft en transformeert in NAD+. Dit is nodig om de glycolyse te waarborgen en wordt fermentatie genoemd. Voorbeelden worden genoemd op bladzijde 92 en 93.

Planten en dieren moeten ook wanneer er geen zonlicht of eten is energie hebben. Om toch energie te hebben, slaan dieren energie op als vet. Glycogeen is voor korte termijn opslag en zit in de lever en spieren. Opgeslagen vet geeft wel twee keer zoveel energie als glycogeen, omdat er in glycogeen veel water zit. Bij planten wordt ATP gevormd via de chloroplasten naar de mitochondria. Ze slaan hun energie op in zetmeel. De meeste diercellen krijgen hun energie van vetzuren ‘s nachts of tussen de maaltijden door.

De pyruvate van de glycolyse wordt in de mitochondria omgezet door drie enzymen, het pyruvate dehydrogenase complex, in CO₂, NADH en acetyl CoA (figuur 2-80, pagina 97). De citroenzuur cyclus (figuur 2-82, pagina 98) maakt NADH door middel van het oxideren van acetylgroepen naar CO₂. Deze gebruikt geen O₂ uit de lucht, maar oxideert wel. Dit wordt niet direct gedaan want de koolstofatomen van de acetylgroep in acetyl CoA, worden eerst omgezet in een vierkoolstof atoom lang oxaloacetaat, om een zes koolstof atoom lange ketting te worden. Vervolgens wordt dit omgezet in CO₂ en energie. Naast NADH, worden er ook gereduceerde FADH₂ (soort NADH) en GTP (soort ATP) geproduceerd.

De laatste stap in het energie verkrijgen, is de elektron-transport ketting door NADH en FADH₂. Ze verliezen hun elektron door het membraan, wat energie oplevert. In de mitochondria komt dit elektron bij een O₂ molecuul waarna het al zijn energie heeft gegeven (oxidatieve fosforlisatie).

Stikstof komt veel voor in de atmosfeer, maar is niet reactief als gas. Maar een paar organismen kunnen dit omzetten in een organische stof (stikstof fixatie). Gewervelden krijgen hun hoeveelheid stikstof binnen door het innemen van eiwitten en nucleïnezuren. De stikstof daarin wordt volledig gebruikt voor nieuwe aminozuren en nucleotides.

Alle bovenstaande gebeurtenissen vinden in één kleine cel plaats. Metabolisme is hier georganiseerd en gereguleerd door verschillen enzymen, substraten, eiwitten, et cetera. De cel overleeft met behulp van controle mechanismes.

3. Eiwitten

Eiwitten hebben vele functies, zoals het opbouwen van een cel, katalyseren, receptor zijn en nog veel meer. Een kinesin beweegt organellen voort door het cytoplasma en topoisomerase kan DNA uit de knoop halen.

De vorm en structuur van eiwitten

Er zijn twintig verschillende aminozuren met unieke eigenschappen die vele eiwitten maken. Ze zitten aan elkaar vast door een covalente peptide bond, waardoor het ook wel eens polypeptides worden genoemd. De polypeptide ruggengraat is de herhalende sequentie van atomen van de polypeptide ketting en de aminozuren zijn de kantkettingen die hieraan vast zitten. De vorm van een eiwit wordt geregeld door conformaties en noncovalente bindingen. Sommigen voorkomen bindingen onderling in het eiwit en sommigen zorgen juist dat een binding extra sterk wordt (met meer noncovalente bindingen). Ook wordt de vorm bepaald door hydrofobische kracht, nonpolair, die het water wegduwt en bepaalde hydrofobe aminozuren binnen houdt. Hydrofiele aminozuren worden juist aan de buitenkant gerangschikt voor bindingen met water. De uiteindelijke vorm, conformatie, dat een eiwit aanneemt, heeft de minste energie nodig om tot stand te komen. De aminozuursequentie heeft alle informatie om de juiste vorm aan te nemen, omdat het automatisch terugvouwt als het ontvouwmechanisme in een laboratorium verwijdert wordt. Een moleculair chaperon helpt ook bij het vouwen van een eiwit.

Er zijn twee vouwpatronen die regelmatig voorkomen. Als eerste is de α-helix gevonden in het eiwit α-keratine in haar en nagels en als tweede is het β-blad gevonden in fibroine van zijde. Deze maken waterstofbruggen tussen de N-H en de C=O groepen in de polypeptide ruggengraat, zodat de aminozuren ongedeerd blijven. Een β-blad vorm kan parallel lopen aan zijn buurman of juist antiparallel. Een α-helix ontstaat door een draai rond zichzelf zodat er een cilinder ontstaat. Elke vierde peptidebinding zorgt voor een binding tussen C=O en N-H. Ook kunnen α-helixen om elkaar heen draaien zodat er een gedraaide spiraal ontstaat. De kant kettingen zitten op dat moment aan de binnenkant.

Er zijn vier levels van structuurorganisatie in een eiwit:

1.      De primaire structuur is simpelweg de aminosequentie.

2.      De secundaire structuur bevat de α-helix en het β-blad.

3.      De tertiaire structuur is in 3D.

4.      De quartaire structuur is een complex van meer dan één polypeptide ketting.

Een eiwitdomein is een aparte structuur dat een bepaalde functie op zich neemt. Het is een deel van de grotere eiwitten.

Er kunnen vele combinaties gemaakt worden van de twintig aminozuren, maar voor een cel zijn er maar een paar nuttig. Dit komt omdat er anders teveel moleculen nodig zijn en de structuren maar bij een paar eiwitten stabiel kunnen zijn. Er heeft selectie plaatsgevonden, waardoor de juiste eiwitten behouden zijn gebleven.

Eiwitten worden ook geclassificeerd op hun aminozuursequentie en de 3D-conformatie in families. Door evolutie zijn er aminozuren verandert, waardoor niet alles meer precies gelijk is gebleven. Als de gelijkenis tussen aminozuursequenties 25% is, wordt er nog naar de structuur gekeken en meestal blijkt dan dat ze dezelfde functie hebben.

Genoomsequenties kunnen aantonen welke organismen verwanten van elkaar zijn. Ook kunnen bekende eiwitfuncties helpen bij het ontdekken van de functies van nieuwe eiwitten. De eiwitdomeinen zijn bouwstenen van grotere eiwitten en zijn ontstaan door nieuwe bindingen tussen de verschillende complexen (domein husselen). De eiwitten zijn veelzijdig doordat ze stevige β-bladen hebben en soepelere sequenties tussendoor, maar ook omdat ze hun C- en N-terminals aan beide uiteinden hebben om nieuwe eiwitten te accepteren.

Bepaalde domeinen werken samen en zijn gevonden in vele eiwitten. Er zijn vele domeinen die samenwerken in de drie takken van de boom des levens, maar sommige zijn alleen gevonden bij een tak en duidt op een speciale functie voor die tak en dat deze ‘laat’ geëvolueerd is.

Het humane genoom heeft 25.000 genen en is daardoor niet per se complexer. Maar wel complexer op de manier waarop het wordt gebruikt. Helaas is de werking van deze complexe eiwitten nog niet helemaal begrepen.

Een bindingsplaats is een oppervlakte van een eiwit dat kan communiceren met andere moleculen door noncovalente bindingen. Hier kunnen ook polypeptides aanbinden waardoor er grote eiwitmoleculen ontstaan. Een ketting in zulke eiwitten heet een eiwit subunit. Ze zitten aan elkaar vast op twee identieke bindingsplaatsen. Een voorbeeld is hemoglobine en bevat twee identieke α-globine subunits en twee identieke β-globine subunits.

Eiwitten zijn opeenvolgende kettingen, omdat dit de minste energie kost om aan elkaar vast te zitten. Vervolgens komen vele units in een helixstructuur terecht, omdat dit door de herhalingen van alle subunits komt  (figuur 3-24, pagina 145). Andere eiwitten moeten juist grote afstanden bedekken (vezel eiwitten). Medieer vezel eiwitten zorgen bijvoorbeeld voor het skelet van een cel. De extracellulaire matrix zorgt voor het binden van cellen om weefsel te vormen. Collageen is een groot voorbeeld voor vezel eiwitten. Het eiwit elastine zorgt ervoor dat weefsel kan uitzetten, zoals  huid en longweefsel, zonder dat het scheurt. Dit komt door de ongestructureerde polypeptide kettingen. Later komen er nog andere functies van ongestructureerde polypeptide kettingen aan bod.

Eiwitten moeten verplaatst worden binnen en buiten de cel, waardoor de structuur kan beschadigen door moleculen van buitenaf. Om de cel te beschermen, zijn er extra covalente kruisverbindingen. De aminozuren of units worden flink aan elkaar gebonden. Een voorbeeld is de disulfide bindingen (S-S). Deze wordt gevormd in het endoplasmatisch reticulum voor transport.

Enzymen en ribosomen zijn grote complexen die worden gevormd door heel veel subunits. Dit heeft enkele voordelen:

·         Een structuur die wordt gevormd door een aantal herhalende sequenties, heeft minder genetische informatie nodig.

·         Alles kan goed in de gaten gehouden worden, omdat de bindingen weinig energie kosten.

·         Fouten in de synthese worden voorkomen doordat correctiemechanismen werken tijdens het samenstellen.

Cirkels, buizen of bollen brengen extra stevigheid met zich mee, omdat er meerdere bindingen gemaakt worden. Virussen beschermen hun DNA in zulke omhulsels.

Vele cellen kunnen zichzelf de finishing touch geven, omdat ze nog montage aan zichzelf kunnen richten. Niet alle noncovalente structuren kunnen dit, maar hebben extra enzymen of andere eiwitten nodig.

Eiwitfunctie

Alle eiwitten binden aan andere moleculen, maar een eiwit heeft twee of drie andere eiwitten/moleculen waar het aanbindt. De substantie waar het eiwit aan zit, wordt een ligand genoemd. De noncovalente bindingen vinden plaats als er veel zijn en het precies allemaal in elkaar past. Het passen gebeurt op een speciale ligand bindingsplaats.

Het oppervlakte van een eiwit bepaalt de chemische eigenschap. Er zijn twee categorieën hoe eiwitten communiceren om de chemische eigenschap te versterken. 1) De interactie met buren van de polypeptide ketting kunnen de toegang van water tegenhouden. Water kan de binding tussen de ligand en het eiwit tegengaan door de waterstofbindingen. 2) Het samenvoegen van polaire aminozuur kantkettingen kunnen de reactiviteit veranderen. Hierdoor verandert de lading van de ketting en kunnen er andere moleculen worden aangetrokken.

Er zijn sequenties bekend van bepaalde functies. Deze kunnen helpen bij het vinden en begrijpen van eiwitdomeinen en hun functies. De sequentie vergelijkingen tussen eiwitfamilies kunnen bepaalde ligand bindingsplaatsen bekend maken. Eiwitten kunnen op drie manieren met elkaar binden:

1.      Oppervlakte-streng interface: een lange streng past precies in een oppervlaktegroeve van een ander eiwit.

2.      Eiwit-eiwit interface: twee helixen draaien om elkaar heen.

3.      Oppervlakte-oppervlakte interface: twee eiwitten passen met hun oppervlakte precies in/op elkaar.

Een antilichaam bindt ook aan een eiwit. Dit eiwit is een organisme/cel die daar op dat moment niet thuis hoort. Vervolgens reageert er een bijbehorend antigen op het antilichaam en doodt het organisme dat niet gewild is. De antilichamen hebben een Y-vorm als bindingsplaats.

De kracht van een (non)covalente binding tussen atomen wordt bepaald door de evenwichtsconstante (K), zie hoofdstuk 2.

Enzymen kunnen alleen functioneren als ze hun ligand tegen komen. De specifieke ligand voor een bepaald enzym heet een substraat. Op deze manier kunnen ze de benodigde reactie-energie verlagen (katalyseren). Er zijn verschillende soorten enzymen:

·         Hydrolase enzymen katalyseren een hydrolyse knip reactie.

·         Nuclease enzymen breken ‘nucleic acids’ af door middel van hydrolyse tussen nucleotides.

·         Protease enzymen breken eiwitten af met behulp van hydrolyse tussen aminozuren.

·         Synthase enzymen maken moleculen in anabolische reacties door het condenseren van twee kleine moleculen.

·         Isomerase enzymen katalyseren de binding in een molecuul.

·         Polymerase katalyseren polymerisatie, zoals bij het maken van DNA of RNA.

·         Kinase enzymen katalyseren het toevoegen van een fosfaatgroep aan andere moleculen.

·         Fosfatase enzymen katalyseren de verwijdering van fosfaatgroepen van een molecuul met behulp van hydrolyse.

·         Oxido-reductase enzymen zorgen voor de oxidatie en reducering van reacties.

·         ATPase zorgt voor een hydrolyse reactie bij ATP.

Het binden van een substraat aan een enzym, is de eerste stap van de katalysatie. Een voorbeeld van een katalysatie is: E + S --> ES --> EP --> E + P. De snelheid van de reactie (Vmax) hangt af van het enzym en de tijd die het nodig heeft om een substraat te verwerken. Een andere parameter is K_m. Dit is de concentratie van het substraat, dat ervoor zorgt dat de maximale reactiesnelheid 0,5 V_max is. Een lage K_m betekent de maximale katalysatie met een lage concentratie van het substraat gebeurt en een sterke binding en een hoge K_m betekent het tegenovergestelde.

Enzymen kunnen een reactie energie geven, omdat ze de concentratie van het substraat verhogen. Ook gebruiken ze de vrije energie om de reactie op een onstabiel transitie level te hebben. Dit wordt de activatie energie genoemd. Ook zijn er katalytische antilichamen die binden aan een onstabiel transitie level. Deze katalyseren ook, maar niet zoveel als een enzym. Ook kunnen enzymen zuren en basen gelijktijdig katalyseren. Dit komt doordat ze precies gepositioneerde atomen hebben die de elektronen verdeling kunnen veranderen die deelnemen aan het maken en breken van covalente bindingen.

Lysozymen katalyseren het knippen van polysaccharide kettingen. Deze zitten in de celwand van bacteriën en moeten voorzichtig geknipt worden, anders scheurt de hele wand. De lysozym knipt de ketting met behulp van hydrolyse. Toch kan een polysaccharide lang in water blijven, omdat de reactie een bepaalde structuur verandering nodig heeft; door het enzym. Als eerste bindt het enzym aan het substraat. Vervolgens reageert de negatief geladen aspartaamzuur met het C1-atoom van de suiker. De zuurstof ontvangt een proton zodat de suiker aan zijn buurman bindt. Hierdoor breekt de suiker binding. Daarna reageert een watermolecuul met het C1-atoom, met behulp van de negatief geladen glutamaat, waarna de hydrolyse voltooid is.

Kleine moleculen geven eiwitten meer functies, die ze niet zouden hebben met alleen maar aminozuren. Rhodopsin receptoren krijgen informatie van kleine, retinale moleculen. Retinale veranderingen zijn verandering in de vorm van het eiwit, dat op dat moment kan werken. Enzymen hebben ook kleine moleculen of metalen bij hun actieve bindingsplaats. Zulke extra kleine moleculen worden ook co-enzymen genoemd. Een voorbeeld is biotin: dit helpt bij het transporteren van een -COO^- molecuul. Deze co-enzymen maken we niet zelf, maar halen we uit ons dieet (vitamines).

Op de katalytische plaatsen zitten moleculaire tunnels, zodat er meer actieve bindingsplaatsen zijn en het proces sneller verloopt. De hele cel werkt zeer efficiënt door alle enzymen zodat er nauwelijks verbetering mogelijk is om de processen nog sneller te laten verlopen. Een reactie die de snelheid van het proces tegenhoudt, heet diffusie limiterend. Als er een diffusie limiterende reactie is, moeten de concentratie hoeveelheden hoog zijn, maar dit lukt vaak niet. Daarom zijn er multi-enzym complexen die het eindproduct van enzym A direct doorgeven aan enzym B. Eukaryotische cellen gebruiken hun organellen met een celmembraan om concentraties in bepaalde delen te verhogen.

Er zijn door bovenstaand proces, eindproduct van enzym A direct naar enzym B, vele paden die allemaal substraten nodig hebben. Hierdoor zijn er enige controlemechanismen nodig. Dit kan door de genexpressie te inhiberen, maar de meeste bekende controletechniek is dat een molecuul op een speciale bindingsplaats buiten de actieve bindingsplaats bindt zodat een substraat niet/minder snel bindt (regulerende bindingsplaats). Hierbij is feedback inhibitie een onderdeel van: een eindproduct zorgt voor de inhibitie van de aanmaak van een product eerder in het proces. Dit is een negatieve regulatie, omdat het een enzym tegenhoudt. Positieve regulatie is wanneer een enzym juist gestimuleerd wordt. Tussen de actieve- en de regulerende bindingsplaats vindt interactie plaats. Deze interactie houdt het conformeren, vervormen, van het eiwit in, zodat een substraat bijvoorbeeld niet meer kan binden. Dit worden dan allosterische enzymen genoemd.

Soms zijn er meerdere substraten voor één bindingsplaats (gekoppeld). Als ze dezelfde conformatie lief hebben, dan moeten ze de affiniteit van het eiwit voor zichzelf verhogen. Als ze een verschillende conformatie dan het andere substraat lief hebben, zorgen ze ervoor dat de andere conformatie niet kan vormen als ze aan het eiwit gebonden zijn. Allosterische eiwitten zijn schakelaars die een cel wel of niet kunnen beïnvloeden. Wanneer symmetrische eiwitten samenvormen, ontstaan er coöperatieve allosterische overgangen. Dit houdt in dat er maar een klein beetje ligand nodig is voor een goede reactie. Bij een geïnduceerd pasmodel worden de substraten vervangen door remmende moleculen; maar dan wel op hun eigen bindingsplaatsen.

Een ander controlemechanisme van eukaryoten is het toevoegen van kleine moleculen aan de kant kettingen van de aminozuren. Een fosfaatgroep wordt hier vaak voor gebruikt. Een fosfaatgroep is negatief geladen en kan daarmee de conformatie veranderen. Ook kan een fosfaatgroep ervoor zorgen dat er meer of minder bindingsplaatsen komen. Een eiwit kinase zorgt voor de additie van fosfaatgroepen. Hierbij verplaatst de fosfaatgroep van een ATP-molecuul naar een watergroep van een kantketting (serine, threonine of tyrosine). Een eiwit fosfatase verwijdert juist een fosfaatgroep (defosforlisatie). Er zijn vele families van kinases, en deze kunnen ook in een evolutieboom gezet worden.

Het verwerken van de input en output wordt gedaan door kinases (microchips). De input komt van de toegevoegde en de verwijderde fosfaatgroepen. Een cyclin afhankelijke kinase (Cdk) functioneert alleen tijdens de celdeling als er een fosfaatgroep verwijdert en toegevoegd wordt en als de cyclin aanwezig is. Het Src eiwit bindt zijn N-terminal covalent aan een hydrofobe vetzuur, dat het eiwit naar het cytoplasma richt. Vervolgens ontstaan er drie domeinen (SH3, SH2 en een kinase katalist) zodat een fosfaatgroep loslaat en de activatie van SH3.

Niet alleen fosfaatgroepen worden gebonden aan eiwitten om te reguleren, maar ook een deel van een GTP. Door hydrolyse van een fosfaatgroep wordt dit eiwit inactief. GTP-bindingseiwitten, of GTPases, worden inactief door een conformatie verandering. De regulerende eiwitten bepalen de activiteit van GTP-bindingseiwitten. Hierdoor wordt bepaald of een GTP of een GDP bindt aan een eiwit. Zo een eiwit is Ras dat inactief is door GTP-ase-activatie eiwit (GAP), dat het GTP afstoot en GDP aanneemt. Als het actief wordt door een ‘guanine nucleotide exchange factor’ (GEF), bindt Ras aan GDP dat wordt afgestoten waarna de GTP onmiddellijk weer terug bindt. Het GTP-eiwit zorgt bij het EF-Tu eiwit dat er een bepaalde conformatie ontstaat. Dit is ook van belang bij tRNA en mRNA paringen. Vervolgens ontstaat er een alpha helix.

De conformatie verandering hierboven beschreven is klein, maar er zijn ook grote conformaties die beweging in cellen kunnen produceren. Dit zijn motor eiwitten die moleculen aanzetten tot beweging om spieren te kunnen bewegen of om enzymen langs DNA te bewegen. Ze bewegen door GTP hydrolyse naar één kant (figuur 3-77, pagina 182).

Allosterische eiwitten zijn microchips (Cdk en Src), montage factoren (EF-Tu) en zorgen voor beweging (motor eiwitten). Ook kunnen ze energie verkrijgen uit ATP hydrolyse, ion gradiënten en elektron transport door pompen en kanalen in het membraan. Een voorbeeld hiervan zijn de ABC (ATP-bindings cassettes) transporteerders. Ze halen hydrofobische stoffen uit het cytoplasma en nog veel meer.

Om nog complexere functies uit te voeren, zoals DNA replicatie of membraan signalering, worden wel meer dan tien eiwitten gebruikt. Dit zijn eiwitmachines. Een voorbeeld hiervan is SCF ubiquitin ligase (figuur 3-79, pagina 185). Deze, en anderen, maakt handig gebruik van de genetische informatie, omdat uit de genen meerdere eiwitten gesneden kunnen worden. Hierdoor kunnen er alternatieve versies ontstaan met unieke functies.

De activatie van eiwitmachines betref vaak het in positie brengen van eiwitunits op specifieke plaatsen. Dit wordt gedaan door de steiger eiwitten. Zij binden activator, remmende, adaptor en substraat eiwitten aan een specifieke locatie in de cel. Dit wordt geïnduceerde nabijheid genoemd, omdat een functie kan veranderen door verschillende afstanden van de eiwitunits.

Al deze functies maken het functioneren van de cel ingewikkeld, ook omdat er zoveel interactie is. Nog steeds zijn wetenschappers bezig om alles te begrijpen. De studie van het proteoom gaat over alles wat te maken heeft met de eiwitten. Ook brengen ze het genoom in kaart (genoom studies). Hierdoor ontdekken ze nieuwe functies, sequenties en interacties (eiwit interactie kaarten). Deze interactie kaarten zijn handig voor het vinden van eiwit functies, omdat ze sequenties of eiwitten voorkomen in bepaalde gebieden (bijvoorbeeld tijdens replicatie). Ze moeten wel voorzichtig bekeken worden, want de eiwitten kunnen meerdere functies hebben. Daarnaast verloopt het ontdekken van functies sneller, als er meerdere sequenties met bijbehorende functies duidelijk zijn. Gelijke sequenties zullen naar alle waarschijnlijkheid dezelfde functie hebben.

4. DNA, chromosomen en genomen

Levende organismen hebben genen waarin erfelijk informatie ligt dat de cel, het individu en de soort opbouwt. Een organisme is afhankelijk waarvoor het gen codeert, zoals een eiwit of een enzym. Alles begon in 1940 en op een gegeven moment kwamen ze erachter dat de informatie op chromosomen ligt. Wetenschappers begonnen met bacteriën en schimmels, om vervolgens DNA en eiwitten te ontdekken. Later kwamen de ontdekkingen over replicatie en translatie.

De structuur en functie van DNA

In 1950 is men erachter gekomen dat DNA ‘simpel’ is opgebouwd met vier subunits en in een dubbele helix is gevormd. Deoxyribonucleic acid (DNA) is opgebouwd uit twee polynucleotide kettingen. Deze kettingen worden strengen genoemd en gevormd door waterstofbindingen. Een nucleotide bestaat uit een fosfaatgroep, deoxyribose en een base; adenine, cytosine, guanine of thymine. Overal zit een 3’ eind, de hydroxylgroep, en aan de andere kant zit een 5’ eind, de fosfaatgroep. Deze hebben overal in de ketting dezelfde breedte nodig. De dubbele helix wordt gevormd door de twee kettingen, waarbij de basen aan de binnenkant zitten. De purines (twee ringen; A en G) paren altijd met een pyrimide (enkele ring; T en C) waardoor er basenparen ontstaan. Een basepaar past, als de twee strengen van de helix antiparallel zijn: de polariteit van een streng is het tegenovergestelde van de andere streng. Hierdoor zijn de basen complementair aan elkaar.

De cellen dragen al het DNA over naar een dochtercel en blijft elke keer hetzelfde. De DNA sequenties coderen voor eiwitten (24.000) en de complete set van DNA sequenties heet het genoom. Aangezien elke streng complementair is aan elkaar kunnen beide strengen fungeren als een template streng (mal). Hierdoor kan een mechanisme kopieën maken van het DNA. Dit DNA zit bij eukaryotische cellen in de celkern, maar bij prokaryoten zweeft dit los in het plasma. Het DNA zit in de nucleaire envelop, gevormd door een lipide dubbellaag membraan en door een kern lamina (skelet). Deze compartimentalisatie is nodig om enzymen buiten te houden.

Chromosomaal DNA en de chromosomen

Het DNA zit verwerkt in chromosomen; de mens heeft 24 verschillende chromosomen. Deze lange draden zijn verpakt in chromatines. De structuur van DNA opvouwen is heel anders in bacteriën, zij dragen hun DNA in een enkele plasmide. Homologe chromosomen worden verkregen van de ouders; één helft van de moeder en de andere helft van de vader. Een uitzondering op deze regel zijn de geslachtschromosomen van jongens, aangezien zij een Y-chromosoom hebben in plaats van een extra X-chromosoom. Om chromosomen in kaart te brengen, worden ze door middel van DNA hybridisatie gekleurd en uitgespreid als een karyotype. De bandenpatronen zijn uniek en als hier een deel mist of extra is, kan dat op bovenstaande manier opgespoord worden.

De chromosomen dragen genen die coderen voor eiwitten. Niet alleen maar eiwitten, maar ook voor RNA moleculen bijvoorbeeld. Meestal correleert ook de complexiteit van een organisme met het aantal genen, maar bij mensen zit er een hoop junk DNA waar de functie nog niet bekend van is. Ook kunnen chromosoomaantallen zeer variëren tussen gelijke soorten.

Het aantal coderende eiwitten is bij mensen zeer laag. Terwijl het genoom erg groot is; 27.000 nucleotides. Hierbij kan er onderscheidt gemaakt worden tussen coderende genen, exonen, en niet coderende genen, intronen. Daarnaast bevatten de exonen regulerende DNA sequenties die bepalen wanneer en waar een gen gekopieerd wordt. De exonen en intronen liggen wanordelijk in het genoom. Hierdoor wordt het lastig om duidelijk te krijgen waar genen beginnen en ophouden. Om de functies van genen te ontdekken, gebruikt men behouden genen die dezelfde functie hebben gehouden. Zo wordt de sequentie vergeleken met de oude en bekende genen om nieuwe genen te ontdekken. Behouden genen zijn gensequenties die de evolutie hebben overleefd. Hier kunnen mutaties in hebben gezeten, maar die zijn niet doorgegeven aan nakomelingen omdat het een nadeel gaf ten opzichte van het oude gen. Deze gebieden bevatten vaak belangrijke genen voor belangrijke eiwitten. De nonbehouden gebieden bevatten geen of minder belangrijke genen. Vergelijkende studies hebben ook ontdekt dat grote delen in ons chromosoom gelijk is aan andere soorten (behouden syntenie).

Chromosomen moeten ook hun informatie kunnen kopiëren en dit gebeurt tijdens de replicatie in de celcyclus. Dit gebeurt in een aantal ordelijke stappen om dochtercellen te vormen. Tijdens de interfase worden chromosomen gekopieerd en tijdens de mitose worden deze chromosomen gedeeld om geplaatst te worden in twee dochtercellen. Hiervoor zijn een centromeer, twee telomeren en replicatie origines voor nodig. Replicatie origines zijn plekken in eukaryotisch en prokaryotisch DNA waar de replicatie, het kopiëren, begint. Het centromeer is nodig om de twee dochterchromosomen uit elkaar te trekken als de cellen delen. De telomeren geven het einde van een chromosoom aan en beschermen deze.

DNA moleculen zitten zeer dicht op elkaar om zo min mogelijk ruimte in te nemen, maar zijn ook zeer dynamisch en kunnen wanneer nodig open breken voor replicatie. De histonen en nonhiston chromosomale eiwitten rollen het DNA op. Deze begrippen, samen met het DNA, vormen de chromatine. Histonen zorgen voor de basis van het oprollen van DNA en zorgen samen voor de opbouw het nucleosoom. Dit bevat acht histonen, twee maal H2A, H2B, H3 en H4, en het DNA van 147 paren lang (figuur 4-23, pagina 212). De positieve histonen zijn niet volledig vlak en kunnen de negatief geladen ruggengraat van het DNA beïnvloeden. Ook vouwen ze zich op bepaalde manieren om wel of niet het DNA beschikbaar te stellen. Histonen zijn al zeer oud, gelijk in andere organismen en een enkele base mutatie kan een histon al verpesten, omdat ze zo verfijnd zijn en al het DNA nodig hebben voor hun eigen productie. Hierdoor blijven ze zo lang behouden in organismen.

Nucleosomen zijn dynamisch zodat er op alle tijdstippen DNA gekopieerd kan worden. Er zijn speciale mechanismen die hiervoor zorgen: chromatine remodeleringscomplexen. Deze zijn ATP afhankelijk en zorgen ervoor dat de nucleotiden langs de nucleosoom kunnen glijden om zo DNA beschikbaar te stellen, wanneer de cel dat nodig heeft. Er zijn verschillende remodelerings-complexen met verschillende functies.

De nucleosomen samen zijn verpakt in een hele lange draad. Wetenschappers weten alleen nog niet precies hoe, maar hebben wel al belangrijke informatie. Een belangrijke factor hierbij is histon H1. Deze bindt zich aan een nucleosoom en heeft bindingen met de verschillende histonen.

De regulatie van de chromatine structuur

De structuur van chromatines wordt doorgegeven aan de nakomelingen. Dit is een voorbeeld van epigenetische overerving dat informatie aan nakomelingen doorgeeft, maar niet op basis van DNA. De histonen werden nooit als belangrijk gezien, maar als een bijproduct van DNA. Toch zijn wetenschappers er mee aan de slag gegaan, omdat ze aanwezig zijn in het DNA, omdat ze zo goed behouden zijn en omdat een deel van de chromatine  de genen stil legt die er om heen liggen en dit vervolgens doorgeeft aan dochtercellen.

Er zijn twee soorten chromatine: 1) heterochromatine is zeer dicht verpakte chromatine en 2) euchromatine is minder strak verpakt. Heterochromatine pakt genen zo strak in, dat ze niet meer gelezen kunnen worden. Een positief effect is het effect dat een gen heeft afhankelijk van de locatie waar dat gen zit. Drosophila en schimmels hebben geholpen om chromatines te begrijpen. De histonkernen worden covalent bewerkt op plaatsen waar de histonstaarten, van H2A bijvoorbeeld, uitkomen. Ze worden bewerkt door acetyl of methylgroepen toe te voegen. Dit gebeurt op een heel precieze manier door regulerende genen. De acetylatie van lysinen aan de N-uiteindes laten de chromatines meer vieren.

Voor elk histon, behalve H4, is er een variant die in mindere mate voorkomt en minder bestand is tegen de evolutie. Deze worden in heterochromatines geplaatst. Een groot verschil tussen ‘echte’ histonen en de varianten is dat de grote histonen gemaakt worden tijdens de S-fase en de varianten tijdens de interfase. Hierdoor krijgen chromatines een grotere diversiteit.

De covalente bewerkingen en de histon varianten werken samen om een histon code te vormen. Deze bepaalt ook de biologische functie van het histon. De histon code is een hypothese die stelt hoe DNA verpakt wordt in nucleosomen. Hierbij worden signalen afgegeven hoe het met dat histon gaat en wat er mee moet gebeuren. Dit wordt gedaan door een code-lezer complex. Deze complexen kunnen signalen afgeven die over een heel stuk chromatine doorgegeven kunnen worden (figuur 4-45, pagina 227).

Door de signalen die een heel stuk verder doorgegeven worden, zijn er barrières nodig die signalen voor bepaalde chromatines tegenhouden bij andere chromatines. Hierdoor ontstaan er chromatine domeinen. Een voorbeeld van een barrière is de HS4 sequentie. De telomeren in chromatines zijn ook speciaal. Deze zitten in centrische heterochromatine dat blijft zitten tijdens de interfase. Deze bevat een speciale variant van de H3. De S. cerevisiae heeft een klein centromeer van 125 nucleotides. De centromeren in complexere organismen zijn groter, maar hebben vele herhalingen (alpha satelliet DNA)

De chromatine structuur wordt overgeërfd, omdat de H3-H4 tetrameren van elk nucleosoom direct worden overgeërfd door de ouderlijke informatie bij de replicatievork. Ook is de informatie voor het onderhoud van centromeren redelijk gelijk aan de informatie voor het onderhoud van heterochromatines. Daarnaast bieden chromatine structuren unieke eigenschappen aan eukaryoten en hun chromosoomfunctie. Bacteriën hebben niet zo een ingewikkeld systeem.

De globale structuur van chromosomen

Een chromosoom wordt opgebouwd door de 30-nm draad van nucleosomen, gevormd in lussen en spiralen. Deze chromatines zijn vloeibaar, zodat het DNA gelezen kan worden wanneer dat nodig is. Een lampbrush chromosoom is het grootste chromosoom dat bekend is en in onrijpe amfibie eieren voorkomt. Het maakt grote hoeveelheden RNA aan. Hierbij kunnen de lussen goed bekeken worden (figuur 4-55, pagina 235). Het DNA blijft voornamelijk op de chromomere, op de as van het chromosoom, en niet in de lussen.

In sommige insecten cellen blijft DNA delen zonder te delen, waardoor er gigantische cellen ontstaan. Cellen met een aparte hoeveelheid DNA is polyploïde. In sommige cellen hoort dit zodat er polytene chromosomen ontstaan. Deze chromosomen bevatten ook banden met DNA (figuur 4-58, pagina 237). Deze chromosomen helpen ook om chromatines te begrijpen. Deze hebben ook nonhistone eiwitten die over lange stukken DNA zitten. Er zijn hierbij verschillende domeinen en dezelfde structuren. Het interfase chromosoom is daardoor een mozaïek van chromatine structuren, omdat het zijn eigen set bewerkingen en varianten heeft. De histon code hiervan kan duidelijk worden door onderzoeken met bindende en fluorescerende antilichamen.

Er zijn verschillende vormen van heterochromatines, omdat de helft van de de heterochromatine polytene banden te zien zijn met een bepaalde antilichaam kleuring. Dit is de aanwijzing dat de andere helft andere chromatines bevat. De chromatine structuur is afhankelijk van de eiwitten die binden aan de DNA sequenties, zoals nucleosoom bewerkingen of non-histone eiwitten.

De chromatines laten meer los als de cel het DNA nodig heeft, maar de chromatine kan ook naar specifieke plaatsen bewegen in de celkern om de genexpressie te veranderen. Dit kan dan een extra grote loop worden, omdat het vaak nodig is bijvoorbeeld.

De nucleolus is waar ribosomale reacties en rijping plaatsvinden. Naast de nucleolus, zijn er nog andere onopvallende organellen die netwerken vormen en reacties teweeg brengen. Dit zijn bijvoorbeeld de Cajal lichamen en de interchromatine granule clusters. Dit zijn compartimenten zonder membranen. Hier wordt nog meer over verteld in hoofdstuk 6. De nucleaire matrix is een intrakernige constructie om de celkern in vorm te houden.

Nu zullen de eigenschappen verteld worden van mitotische chromosomen, in plaats van interfase chromosomen. Een mitotisch chromosoom bevat uit twee geclusterde zuster chromatides (één been en/of arm van een chromosoom). Dit chromosoom bevat nog enige (RNA)-moleculen en als dit verwijderd is, kan de hele structuur onder de microscoop bekeken worden. Dit wordt gezien als de laatste laag in de hiërarchie van chromosoom verpakkingen. De verpakking van chromosomen is van belang wanneer de zusterchromatides naast elkaar liggen, om verplaatst te worden naar zustercellen. Ook is het handig, omdat het zo de DNA sequentie beschermt. De verpakking van chromosomen wordt onder andere gedaan door condensins, bepaalde eiwitten. Zij gebruiken de energie van ATP om twee DNA moleculen te laten draaien zodat de chromatiden ontstaan.

Hoe genomen evolueren

Genomen worden vergeleken met elkaar om sequenties te begrijpen en om verwantschap tussen dieren te bepalen. Hierdoor weet men dat hele sequenties hetzelfde zijn gebleven tussen organismen (homologen). Deze zijn gelijk in sequentie en functie door een gedeelde voorouder. De genoomgrootte, het aantal chromosomen, de genvolgorde, de grootte van de introns en het aantal herhalende sequenties verschillen wel zeer veel per organisme. De complexiteit van het fenotype van een organisme is vaak wel gecorreleerd met het aantal genen.

De meeste fouten worden gemaakt tijdens de replicatie en translatie procedures, maar kunnen ook weer hersteld worden. Toch blijven er ook mutaties bestaan en daar werkt de evolutie op. Deze laat ze wel of niet voortleven. De mutaties kunnen enkele baseparen betrekken, maar ook hele chromosoom duplicaties. Hier spelen mobiele elementen, transposons, een grote rol, maar deze komen in latere hoofdstukken nog aan bod.

Hoe langer de tijd duurt dat een soort uit elkaar is geëvolueerd, hoe groter de diversiteit in genoomsequenties tussen die twee. Om verschillen in sequenties tussen organismen duidelijk te maken, worden fylogenetische bomen in kaart gebracht. Organismen houden dezelfde genen door zuiverende selectie: selectie die individuen elimineert die een mutatie dragen dat belangrijke eiwitfuncties verstoort. RNA eiwitten zijn bijvoorbeeld zeer gelijk tussen soorten.

De fossielen zijn goede aanwijzingen voor evolutie van soorten. Fossielen hebben ook een grote bijdrage geleverd aan de opbouw van de fylogenetische boom. De snelheid van evolutie gaat op een constant tempo (moleculaire klok). Deze houdt zich voornamelijk bezig met delen van chromosomen die overgeslagen worden door selectieve evolutie, zoals intronen.

De mens en de chimpansee lijken zeer veel op elkaar. Maar ook vergelijkingen tussen de muis en de mens helpen met het begrijpen van sequentie evolutie. Er zijn zo’n 180 breek en hervorm momenten geweest in de genomen sinds de muis en mens gescheiden zijn. Ze hebben vele genblokken hetzelfde: syntenie. Er is in al die tijd ook veel DNA verloren gegaan, bij de mens en de muis, maar dit is gecompenseerd door transposons en genduplicaties.

Mensen en andere zoogdieren hebben ongeveer drie biljoen nucleotides en vissen een biljoen nucleotides. De kogelvis heeft 0,4 biljoen nucleotides, omdat het minder intronen heeft. Ook heeft deze vis meer DNA verloren, dan verkregen.

De DNA sequenties van uitgestorven dieren zijn moeilijker te verkrijgen, maar het is wel mogelijk. Telkens wordt er gekeken naar soorten die voor het laatst van elkaar gescheiden zijn. Een voorbeeld zijn de DNA sequenties van de mens en de chimpansee. Vervolgens wordt er gekeken naar de DNA sequentie van de gorilla om te zien welke genen veranderd zijn. Ook kunnen deze vergelijkingen helpen om de functies van die sequenties duidelijk te maken. Dit kan omdat sommige sequenties tussen heel veel soorten hetzelfde is gebleven (multisoort behouden sequenties). De bekende DNA sequenties helpen ons om genetica beter te begrijpen en om betere medicijnen te maken voor mensen.

Daarnaast kunnen versnelde veranderingen in behouden sequenties helpen om de kritieke stappen in de menselijke evolutie te ontcijferen. Dit zijn menselijke versnelde gebieden (human accelerated region; HAR). Zo een gebied is verschillend tussen de mens en de chimpansee. Een voorbeeld is dat mensen bepaalde genen meer hebben voor de ontwikkeling van de cortex.

Er zijn dus ook genen die verdubbelen. Dit worden genduplicaties genoemd. Vervolgens kunnen deze duplicaties een verschillend lot ondergaan:

·         Een duplicatie kan zijn functie verliezen, waardoor de verantwoordelijkheid ligt bij de originele kopie. Dit wordt een pseudogen genoemd en kan wel in het genoom blijven zitten.

·         Ook kunnen genen dupliceren en divergeren, hierbij krijgt de duplicatie een nieuwe functie ten opzichte van zijn tweelingbroer.

·         Ook kunnen er hele genoomsequentie verdubbelingen zijn. Dit gebeurt doordat een kiemcel zichzelf helemaal deelt en vervolgens zichzelf niet deelt in twee dochtercellen.

De evolutie van de globine gen familie laat zien hoe genduplicaties resulteren in en bijdragen aan de evolutie van organismen. Een globine gen dupliceerde 500 miljoen jaar geleden waardoor er een alpha- en een beta-globine ketting ontstond. Een zuurstofbindend molecuul bestaat uit twee alpha-globine moleculen en twee beta-globine moleculen. De beta-globine is nogmaals geëvolueerd en de duplicatie had een hogere affiniteit voor zuurstof. Deze komt vaak voor in foetussen. Later is de nieuwe beta-globine nog eens tweemaal gedupliceerd en gemuteerd (y en e). De volwassen beta-globine is zelf nog eens gedupliceerd en gemuteerd in delta beta globine. Ook zijn er genduplicaties die veranderd zijn in pseudogenen.

Genen die gedupliceerd zijn, kunnen ook ergens anders in het genoom gepland worden. Hierdoor ontstaan er nieuwe aminozuursequenties en nieuwe eiwitten. Dit gebeurt door recombinatie van exonen: stukken genen breken en worden op een andere plek weer vastgezet.

Een duplicatie kan ook resulteren in een neutrale mutatie: dit is niet positief noch negatief voor een soort. Vervolgens verspreidt zich dit door de gehele populatie. De snelheid van de verspreiding hangt wel af van de populatiegrootte; 1/(2N). Deletie mutaties worden weggezuiverd door natuurlijke selectie of ze worden door kiemcellen elke keer weer gevormd, zodat deze ‘vast’ komen te zitten in de populatie. Dit gebeurt ook met neutrale mutaties.

Ondanks de diversiteit tussen mensen en hun genomen, kan er veel geleerd van worden. Single-nucleotide polymorfismes (SNPs) zijn puntmutaties die maar één andere base betrekken ten opzichte van ‘normale’ sequenties. Polymorfismen tussen individuen zijn op uiterlijk gebaseerd en geven al een indicatie welke genen zij hebben.

5. DNA replicatie, reparatie en recombinatie

Voordat een cel twee dochtercellen kan maken, moet het DNA gekopieerd worden. Daarnaast is het van belang voor de lange-termijn overleving van een organisme, dat het DNA ‘verandert’. De evolutie kan reageren op aanpassingen in het DNA, zodat de sterkste organismen overleven.

Het behoud van DNA sequenties

Mutaties zijn veranderingen in de DNA sequenties die niet hersteld worden door reparatiemechanismen, maar voor altijd in het genoom blijft. De mutatiesnelheid kan bepaald worden uit onderzoeken met bijvoorbeeld de Escherichia coli. De E. coli deelt binnen 40 minuten waardoor er snel een hele grote populatie ontstaat. Hier is uit gebleken dat de mutatiesnelheid één nucleotide verandering per 109 nucleotides per celgeneratie betreft. Deze snelheid is later terug gevonden in de C. elegans. Ook worden er berekeningen gedaan met fossielen en mutatiesnelheiden om te ontdekken hoelang een enkele mutatie nodig heeft. Dit zijn alleen schattingen en zullen de mutatiesnelheid onderschatten, omdat er mutaties gemist worden door deleties. Mensen en de E. coli verschillen in voortplanting, maar hun mutatiesnelheid is hetzelfde.

De lage mutatie snelheid is van belang voor het leven van nu, want als het lager was zouden er maar 5000 essentiële genen gevormd worden en zouden er geen complexe organismen ontstaan zijn. Er zijn twee soorten cellen van seksueel voortplantende organismen: 1) kiemcellen geven de genetische informatie aan nakomelingen door en 2) somatische cellen zorgen voor de opbouw van het organisme. Kiemcellen moeten behouden blijven, zodat het DNA goed blijft. Somatische cellen moeten behouden blijven, omdat anders individuen minder sterk zijn. Ook ontstaat kanker door fouten in de somatische cellen.

DNA replicatie mechanismen

Het vormen van baseparen is de basis voor DNA replicatie en herstel. Een template, een mal, wordt gebruikt om de complementaire basen te binden. Hierbij helpt het enzym DNA polymerase om de basen te binden.

De dubbele helix die ontstaat na replicatie is semiconservatief, omdat het een nieuwe en een oude streng samen betreft. Dit begint bij de replicatievork dat DNA polymerase bevat. Bij het maken van de twee strengen is er één probleem: het DNA wordt in 5’-3’ richting gelezen, maar één streng loopt van 3’ naar 5’. Hierdoor worden er telkens stukjes, Okizaki fragmenten, gelezen van 3’ naar 5’. Vervolgens worden deze stukjes aan elkaar geplakt. Hierdoor is de replicatievork asymmetrisch. Het bestaat uit een leidende streng (continu) en een achterblijvende streng (‘lagging’; discontinu).

Fouten worden gemaakt tijdens replicatie en soms worden er baseparen gevormd tussen niet complementaire basen (bijvoorbeeld A met G). Om dit te verbeteren, vindt er correctie (‘proofreading’) plaats. De eerste correctiestap wordt gedaan door DNA polymerase, omdat het paren van de juiste basen een voordeligere energie oplevert dan niet complementaire baseparen. De volgende controleur is de exonucleolytische correctie, uitgevoerd door DNA polymerase en zijn enzym exonuclease. Deze kijkt naar verkeerd geplaatste basen en vervangt ze door de juiste base. Deze zelfcorrectie heeft een primer nodig voor de synthese van een nieuwe streng. RNA daarentegen niet, omdat fouten in het RNA niet lang blijven bestaan.

De efficiënte correctie mechanismen vinden alleen plaats in de 5’-3’ richting, omdat in de 5’-3’ richting de fosfaatgroep van het einde, 5’, gebruikt wordt in plaats van de binnenkomende mononucleotide. Hierdoor zal de synthese direct stoppen.

Er zijn nog meer enzymen die werken bij de replicatievork. Één daarvan is DNA primase en zorgt ervoor dat DNA gekopieerd wordt. Bij de leidende streng is er maar één nodig, maar bij de achterblijvende streng zijn er meerdere nodig, omdat er telkens een nieuw stukje gemaakt moet worden. DNA primase gebruikt ribonucleoside trifosfaat om RNA primers te maken. De RNA synthese is gebaseerd op hetzelfde principe als DNA replicatie. De RNA primer heeft een 3’-OH groep op het eind en kan zo een Okizaki fragment beginnen te maken. Vervolgens eindigt dit stuk in het 5’ van een vorig stuk. Om hier een heel stuk van te maken, wordt DNA ligase gebruikt. Deze verwijdert de oude RNA primer en vervangt het met DNA.

Er zijn ook speciale eiwitten die helpen bij het openen van de dubbele helix. Door het openen kunnen er basen binden aan de template streng. Het openen kost zeer veel kracht en daarom zijn er replicatie eiwitten die daarbij helpen. DNA helicasen zijn eiwitten die binden aan enkelstrengs DNA en ATP hydrolyseren. Dit zorgt ervoor dat ATP vervormt waardoor er beweging mogelijk is. Vervolgens loopt de helicase tegen een dubbele helix aan, nog steeds vast aan enkelstrengs DNA, en loopt door terwijl het de helix splitst. Een helicase die van 5’ naar 3’ beweegt, heeft de dominante rol. Enkel-strengs DNA-bindingseiwit bindt aan het blootgestelde DNA om te zorgen dat het niet weer terugvormt in een helix. Ook voorkomt het de vorming van haarpin helixen tussen één enkele streng.

DNA polymerase bindt een paar basen aan de enkele strengen, maar veel meer met behulp van een glijdende klem. Deze houdt de polymerase op het DNA en laat het los wanneer het dubbelstrengs DNA tegenkomt. De glijdende klem is een cirkel dat vastzit aan de polymerase en om het DNA. Hierdoor blijft de snelheid van replicatie behouden. De klem wordt erop gezet door een klem lader dat ATP hydrolyseert. Bij elk Ozaki fragment gebeurt dit opnieuw.

De eiwitten die hierboven genoemd zijn, zitten meestal allemaal bij elkaar op een multi eiwit complex in plaats van apart. Om dit in beeld te krijgen, is figuur 5-19 op pagina 276 handig.

Er zijn mutator genen waar mutaties sneller hun gang kunnen gaan, omdat zij de 3’-5’ correctie exonuclease kapot maken. De fouten die de RNA polymerase hierdoor overslaan, worden gecorrigeerd door het streng geregisseerd mismatch herstel mechanisme. Deze vindt de noncomplementaire baseparen. Dit mechanisme is gebaseerd op de GATC sequenties net na de replicatievork die nog niet gemethyliseerd zijn. Hierbij worden misplaatste basen herkend, verwijderd en vervangen door de juiste base.

DNA topoisomerase zorgt ervoor dat de helix niet terugvormd na de replicatievork. Dit doet dit mechanisme door zichzelf covalent te binden aan een fosfaatgroep, zodat een fosfordi-ester binding tijdelijk verbroken wordt. Topoisomerase 1 zorgt voor een knip in één streng zodat aan beide kanten van de knip de strengen kunnen draaien. Topoisomerase 2 zorgt voor twee brekingen in de strengen. Dit doet de topoisomerase met ATP hydrolyse op de volgende manier:

1.      Topoisomerase 2 breekt een dubbele helix om een gat te vormen;

2.      Hierdoor past er een andere dubbele helix in de buurt doorheen;

3.      Als laatste bindt het de gaten weer aan elkaar en verwijdert zich van het DNA.

Het bovenstaande zorgt ervoor dat twee opgesloten cirkels vrijkomen.

Het principe van DNA replicatie is gelijk in eukaryoten en bacteriën. Door bacteriën en gist hebben we zoveel geleerd over DNA replicatie.

De initiatie en voltooiing van DNA replicatie in chromosomen

Het begin van de replicatie ligt bij de initiatie eiwitten en de replicatie origines. De replicatie origine is de plek waar het DNA als eerste open gaat. Deze worden geopend door initiatie eiwitten waarbij A-T minder waterstofbindingen huishouden dan G-C en dus relatief makkelijker open gaan.

E. Coli heeft één circulair DNA en het kopiëren van DNA begint ook hier bij één replicatie origine. Vervolgens zijn er initiatie eiwitten die een eiwit complex vormen die weer andere eiwitten aantrekken. Deze ‘andere’ eiwitten zijn DNA helicase, gebonden aan een helix (klem) lader, dat DNA ontrolt. Daarna worden de RNA primers gemaakt en kan het kopiëren in beide richtingen ten opzichte van de origine beginnen.

De eukaryotische genomen zijn groter en hebben daardoor meerdere replicatie origines. De techniek autodiografie heeft geholpen om dit te ontdekken, want het laat de verspreiding van gekleurde emulsies zien aan gebonden en/of nieuw DNA. Ook is gebleken dat origines in clusters (20-80 origines; replicatie units) voorkomen, units worden op verschillende tijden geactiveerd, individuele origines liggen in clusters 30.000-250.000 nucleotides van elkaar af en vanaf de origine gaat de replicatie twee kanten op.

Bij eukaryoten wordt het DNA alleen gekopieerd tijdens de S(ynthese) fase. Als al het DNA is gekopieerd, wordt het bij elkaar gehouden tot de M(itose) fase. De origines zijn niet allemaal tegelijkertijd actief, maar worden actief gesteld in een bepaalde volgorde. De volgorde waarin ze actief worden gesteld, ligt aan de chromatine structuur. Dicht verpakte chromatines worden later gekopieerd, dan losser verpakte chromatines. Dit is ook terug te vinden in X-chromosomen bij vrouwen, omdat het X-chromosoom gekopieerd wordt omdat het de minst dicht verpakte chromatines bevat. Het andere X-chromosoom wordt inactief gesteld.

De replicatie origines zijn specifieke DNA sequenties, in de simpele eukaryoot gist. Er zijn ook sequenties die onafhankelijk van het grote chromosoom kopiëren. Dit zijn autonome replicatie sequenties (ARS). Deze overleven en hebben veel klonen op een petrischaaltje, als deze die bepaalde sequentie bevatten.

Een replicatie origine bevat drie onderdelen: 1) een origine herkenningscomplex, 2) een stuk DNA dat bestaat uit veel A-T bindingen en 3) tenminste één bindingsplaats voor eiwitten om het origine replicatie complex (ORC) naar de origine te brengen. De eiwitkinases zorgen ervoor dat het DNA niet opnieuw gekopieerd wordt als alles gekopieerd is. De zoogdier sequenties die helpen om replicatie te beginnen, zijn moeilijk te vinden. Dit komt verder nog in hoofdstuk 7 aan bod.

Als het DNA gekopieerd is, moet het weer verpakt worden in nucleosomen. Dit wordt gedaan na de replicatievork. Bovendien zijn er sequenties die voor de histonen coderen tijdens de S-fase. De benodigde hoeveelheid histonen wordt gemaakt voor het nieuwe DNA. De octameren worden tijdens DNA replicatie opengebroken in een H3-H4 tetrameer en een H2A-H2B dimeer. De H3-H4 tetrameer blijft zitten en voor de nieuwe streng wordt er een nieuw tetrameer gemaakt. De H2A-H2B dimeer wordt verdeeld over de strengen; de helft is nieuw en andere helft is oud. De factoren die hierbij helpen zijn histon chaperonen.

Het laatste stukje bij een achterliggende streng kan niet worden gekopieerd, omdat het geen ruimte biedt voor een primer. Bacteriën hebben dit niet, omdat ze circulair DNA hebben. Mensen lossen dit op door aan het eind vele herhalende sequenties te hebben. Deze worden herkend en telkens aangevuld door DNA telomerase in de 5’-3’ richting. Hier blijft een stukje 3’ DNA over dat een lus vormt en terugkomt in het DNA, een t-lus. Dit zorgt ervoor dat het DNA beschermd blijft. De telomeren zorgen er ook voor dat er een limiet is aan celdelingen. Sommige kunnen altijd blijven delen, denk aan huidcellen, maar bij andere cellen houdt de telomerase sequentie op waardoor er stukjes verdwijnen van chromosomen (replicatieve cel veroudering). Het hebben van korte telomerase sequenties is een risico. Hier hebben mensen een gezond en een ziek allel tegen de telomerase functie.

DNA herstel

DNA herstel behoudt het originele DNA en maar één op de duizend mutaties blijft daadwerkelijk in het DNA. Veel DNA van een organisme codeert voor herstelmechanismen. Spontane schade, zoals spontane depurinatie (verlies van A en G door hydrolyse tussen N-glycosyl en deoxyribose) of deaminatie (C --> U), leidt tot verandering in de DNA sequenties. Als dit niet werd hersteld, zou een organisme niet overleven. De dubbele helix is erg handig voor DNA herstel, omdat als de ene streng kapot is, de andere streng dit kan opvangen, omdat ze complementaire basen hebben.

Er zijn twee manieren waarop DNA schade verwijderd kan worden. Beiden gebruiken de stappen schade verwijderen, originele DNA sequentie invoegen met behulp van de complementaire streng en alles weer vastlijmen door middel van ligase. De eerste is base excisie herstel en maakt gebruik van DNA glycosylases om de fouten te ontdekken en te hydrolyseren. Het gat wordt herkende door AP endonuclease en hersteld. Het tweede mechanisme is het nucleotide excisie herstel mechanisme. Deze vindt uitstekingen in de helix, door pyrimidine dimeren, en hersteld deze.

Het DNA dat de hoogste urgentie heeft, wordt omringd door herstelmechanismen. Dit wordt gedaan door RNA naar het beschadigde DNA te brengen en door middel van gekoppelde eiwitten haalt RNA herstelmechanismen naar de plek. De fouten basen zijn makkelijk te herkennen, omdat hun chemie anders is dan de originele basen. Wanneer DNA ernstig beschadigd is, zijn de bovenstaande herstelmechanismen niet genoeg. Er worden op dat moment andere DNA polymerases gebruikt. Deze zijn alleen minder accuraat, want ze missen de exonucleolytische correctie. Wanneer beide strengen gebroken zijn, is er geen template om te gebruiken. Een oplossing hiervoor is non homologe eind aansluiting. Hierbij worden de dubbele strengen weer aan elkaar gebonden, maar wel met mogelijk verlies van nucleotiden. Een accuratere versie hiervan is wanneer de zusterchromatide na het kopiëren gebruikt wordt als template. Dit wordt homologe recombinatie genoemd.

De reparatie van beschadigd DNA neemt tijd in en remt de replicatie van DNA, omdat het langs checkpunten moet.

Homologe recombinatie

Homologe recombinatie is de genetische uitwisseling tussen een paar homologe DNA sequenties. Deze vorm van recombinatie is cruciaal voor dubbele brekingen in het DNA. Ook is het cruciaal voor de overleving van een organisme, omdat anders de dubbele breking kapot gaat, maar ook omdat het zorgt voor nieuwe genencombinaties op elk chromosoom dat voordelig kan zijn tijdens evolutie. En bovendien helpt het bij het accuraat scheiden van chromosomen. De strengen moeten zeer dicht bij elkaar zijn, wil het lukken. DNA hybridysatie is wanneer twee strengen een homoloog stukje gen hebben, zodat deze binden en vervolgens de rest van de strengen ook aan elkaar binden. Het DNA moet wel open liggen, en dit wordt gedaan met behulp van de eerdere genoemde enkel-strengs DNA-bindingseiwitten. Hierdoor ontstaat een heteroduplex: strengen van twee andere DNA moleculen komen samen. Het paren tussen twee homologe strengen van andere DNA moleculen betreft de streng invasie door bepaalde eiwitten.

Het RecA eiwit in E. coli, en zijn homoloog Rad51 dat in elke eukaryoot voorkomt, zorgt ervoor dat DNA strengen bij elkaar blijven, maar ook dat er nieuwe combinaties worden gemaakt. Hierbij opent RecA het DNA doordat het meerdere bindingen op DNA aan kan gaan. Vervolgens zoekt het DNA een homologe streng en vormt er een heteroduplex. De eerdere ‘eigen’ streng wordt weggedaan. Dit proces wordt geholpen door branch migratie. Dit zorgt voor het vergroten van heteroduplex gebieden of het loslaten van nieuw enkelstrengs gemaakt DNA.

Homologe recombinatie zorgt ervoor, zoals eerder gezegd, dat beschadigd DNA zonder verlies van nucleotiden gemaakt wordt. Helaas heeft het ook nadelen. Het kan ervoor zorgen dat een verkeerde streng gekopieerd wordt, zodat er verlies van heterozygotie optreedt. Hierdoor ontstaan vele soorten kanker. Daarnaast worden vele eiwitten opgeroepen om te helpen bij homologe recombinatie en deze komen dan ook in hoge mate voor. De bedoelde eiwitten kunnen in grote hoeveelheden ook zorgen voor kanker of celdood. Ook kunnen te weinig eiwitten zorgen voor kanker. De E. coli gebruikt het SOS respons systeem dat zorgt voor het overleven van de cel en het zorgt voor een hogere mutatiesnelheid dat op de lange termijn in combinatie met evolutie voordelig kan zijn.

Nieuwe DNA sequenties worden gevormd tijdens de kruisstreng uitwisseling (Holliday junction; 5-61, op pagina 311). Hier vormen twee DNA strengen een kruis en wisselen van partner. Hier wordt ATP gebruikt om de branch migratie te helpen. Meiotische recombinatie begint met een geprogrammeerde dubbele streng breking. Vervolgens ontstaat er een dubbele Holliday junction, omdat er twee verschillende DNA helixen ‘binnenkomen’ bij het eiwit dat voor de dubbele breking zorgt. Vervolgens worden de DNA helixen gespleten en samengevoegd met een streng uit de andere helix. De twee helixen komen hier van de twee ouders en worden gecombineerd. Toch zijn er twee soorten. De eerste soort is wanneer er geen crossing over plaatsvindt, omdat er geknipt wordt op plaatsen zodat de twee originele helixen scheiden van elkaar. De tweede soort is wanneer er wel crossing over plaatsvindt, omdat de opwaartse en neerwaartse chromosomen verwisseld worden. Uiteindelijk ontstaat er wel een heteroduplex.

Nakomelingen krijgen alle informatie van hun ouders en dit wordt eerlijk verdeeld. De ene helft van

de vader en de andere helft van de moeder. Alternatieve vormen van genen worden allelen genoemd. Deze kunnen zorgen voor het transporteren van DNA sequenties van de ene helix naar een andere helix. De eerste helix blijft hetzelfde, maar de andere helix verandert qua sequentie. Dit wordt genconversie genoemd en vergt vaak verschillende recombinatie processen.

Correctiemechanismen voorkomen de uitwisseling tussen een normale streng en een streng met fout geplaatste basen. Hierdoor ontstaan er geen vreemde recombinaties, waardoor het genoom misschien kapot van gaat.

Transpositie en conservatieve plaatsspecifieke recombinatie

Er zijn nog twee speciale vormen van recombinatie en dat zijn transpositie en conservatieve plaatsspecifieke recombinatie. Deze vormen zorgen er voor dat de genvolgorde verandert wordt en dat er nieuwe informatie op het genoom komt.

Mobiele elementen die door transpositie in het genoom verplaatsen worden transposons of wegwerp elementen genoemd. De transposons verplaatsen in het genoom doordat ze transposase maken en dit in een doel stoppen, zodat ze zichzelf er kunnen neerzetten. Er zijn drie soorten transposons:

·         DNA transposons

·         Retrovirale soort retrotransposons

·         Nonretrovirale soort retrotransposons

DNA transposons bestaan alleen uit DNA als ze zich verplaatsen. Ze verplaatsen zich door middel van de knip en plak transpositie of door middel van de replicatieve transpositie. De knip en plak transpositie zorgt ervoor dat het gen dat voor transposase codeert eruit geknipt wordt en ergens anders terecht komt. Het gat dat overblijft wordt dichtgemaakt door recombinationele dubbelstrengse breking, homologe recombinatie of door nonhomologe eind samenvoeging. De replicatieve transpositie ontstaat doordat er replicatie plaats vindt tijdens de transpositie. Een kopie blijft in het origineel en de nieuwe kopie wordt ergens anders ingebouwd.

Een bacteriofaag is een virus dat een bacterie infecteert. Retrovirussen zijn organismen die een cel binnendringen met enkelstrengs RNA. Door omgekeerde transcriptase wordt er DNA gemaakt aan dat RNA en vervolgens wordt er aan die nieuwe streng weer DNA gemaakt. Daarna gebruikt het virus een transposase, integrase, om het DNA in het genoom van de gastheercel te brengen. Vervolgens wordt dit DNA gekopieerd door de gastheer en zijn replicatie en translatie mechanisme. Retrovirale soort retrotransposons gebruiken dit mechanisme ook, maar zorgen dat de gastheercel blijft leven en dat hun RNA wordt vertaald in mRNA.

Nonretrovirale soort retrotransposons zijn een heleboel herhalende sequenties. De transposons in deze categorie die zichzelf nog kunnen verplaatsen zijn LINEs (long interspersed nuclear elements). Deze bevatten het complex voor endonuclease en omgekeerde transcriptase. De transposons die zich niet meer kunnen verplaatsen zijn SINEs (short interspersed nuclear elements). Deze bevatten geen genen voor endonuclease of omgekeerde transcriptase.

Alle drie de transposons worden gevonden in mensen en fruitvliegjes. DNA transposons worden alleen gevonden in bacteriën. Genoomsequenties kunnen ook laten zien hoe vaak de transposons versprongen zijn in het genoom.

Conservatieve plaats-specifieke recombinatie zorgt voor de herschikkingen van andere soorten transposons. Het onderscheidt zich van transpositie, omdat het speciaal DNA betreft op de donor en acceptor sequentie en omdat het andere mechanismen betreft (gebruik van topoisomerase, etc.). Deze vorm van recombinatie is gevonden in de bacteriofaag lambda. Het kan een gen stilleggen, omdat het DNA invoegt midden in een gen wat daardoor onwerkzaam wordt.

6. Hoe cellen het genoom lezen: van DNA naar eiwit

De genomen in organismen coderen voor alle onderdelen, vormen en eigenschappen van dat organisme. Dit wordt gedaan door transcriptie (DNA kopiëren) en translatie (vertalen van aminozuren in eiwitten). Het centrale dogma in de moleculaire biologie is dat eiwitten gecodeerd worden van DNA naar RNA.

Van DNA naar RNA

De eerste stap die nodig is om van DNA eiwitten te maken, is de transcriptie van een gen in RNA. RNA is qua nucleotide sequentie identiek aan het DNA, maar verschilt op twee punten: 1) RNA heeft ribonucleotides dat een ribose suiker bevat in plaats van een deoxyribose en 2) de base T wordt tijdens de transcriptie vervangen door de base U. Om bij de basensequentie van het DNA te komen, moet de dubbele helix open. Hierbij dient één streng als template streng en ontstaat er een transcript. De replicatie wordt gedaan met behulp van de RNA polymerase en de nucleoside trifosfaten (ATP, CTP, UTP en GTP) in de 5’-3’ richting. Doordat de nieuwe base vrijwel direct loslaat, kan er een nieuw RNA molecuul gevormd worden terwijl de vorige nog bezig is. Daarnaast begint het maken van een RNA molecuul met polymerase zonder primer. Hierdoor worden er alleen wel meer fouten gemaakt, maar dat is minder erg, omdat een RNA molecuul niet levenslang meegaat. Als er een fout wordt gemaakt, keert de polymerase om en hersteld dit.

Genen kunnen coderen voor verschillende typen RNA. Eentje daarvan is messenger RNA (mRNA) en is het eerste RNA dat gevormd wordt uit een stukje gen. Later komen er nog meerdere RNA typen aan bod.

Het bacteriële RNA polymerase enzym zorgt ervoor dat DNA gelezen wordt en de sigma factor helpt waar de transcriptie mag beginnen. Samen wordt dit het RNA polymerase holo-enzym genoemd. Als dit enzym de promoter tegenkomt, de speciale startsequentie, bindt de polymerase extra strak en de sigma factor herkent de promoter. Hiervoor gaat tijdelijk de helix open, waarvoor geen ATP energie nodig is. Dit komt doordat de polymerase en het DNA beide een structurele verandering ondergaan. Wanneer het complex bij een terminator komt, is de transcriptie afgelopen en zoekt de vrije sigma factor weer een polymerase om mee samen te werken. Als een RNA molecuul stopt of loslaat voor het einde, begint alles weer opnieuw. Een terminal kan werken door middel van een haarpin structuur. Deze bestaat uit vele A- en U-basen die samen binden, waardoor het RNA transcript stopt.

Er zijn vele verschillende start en stopsignalen in de DNA sequenties. Hierdoor wordt gebruik gemaakt van de overeenkomende nucleotide sequenties. Deze methode vergelijkt vele sequenties met dezelfde functie en kijkt welke nucleotide volgordes het meest voorkomen. Hoe sterker een promoter is, hoe meer eiwit deze maakt. Daarnaast kan er maar in één richting gekopieerd worden vanaf het DNA in RNA, omdat de promoter asymmetrisch is.

Bovenstaand is beschreven hoe de situatie is in bacteriën tijdens transcriptie, maar bij eukaryoten zijn er extra enzymen en eiwitten, omdat er meer DNA is. Eukaryoten bevatten drie soorten polymerases:

·         Polymerase 1 en 3 kopiëren de genen die coderen voor transfer RNA, ribosomaal RNA en andere kleine RNA’s.

·         Polymerase 2 kopieert de meeste genen die voor eiwitten coderen.

Ook bevatten bacteriën één extra eiwit, de sigma factor, terwijl eukaryoten tijdens de RNA transcriptie meer eiwitten nodig hebben (algemene transcriptie factoren voor polymerase 2). Om de transcriptie te beginnen, is de beginsequentie nodig (TATA-box; TATTAA). Vervolgens bindt de TF2D aan de TATA box met behulp van TBP en start TF2B. De rest, net zoals polymerase 2, bindt aan de promoter. TF2H gebruikt ATP om de helix uit elkaar te halen en fosforlyseert RNA polymerase 2 zodat de vorm verandert en de algemene transcriptie factoren loslaten. Hierdoor kan de transcriptie echt beginnen. De vorm verandert van polymerase 2, omdat er een fosfaatgroepen staart, het C-terminal domein, ontstaat. Naast al het bovenstaande heeft polymerase 2 ook nog een activator, een mediator en een chromatine bewerkingseiwit nodig (om bij het DNA te komen). De activatoren op speciale DNA sequenties helpen om de polymerase 2 aan te trekken. De mediator zorgt ervoor dat de activatoren en polymerase 2 goed communiceren. Daarnaast is het DNA opgerold bij eukaryoten in nucleosomen en hebben te maken met chromatine structuren.

Om te zorgen dat de polymerase op het DNA blijft, worden er verlengende factoren toegepast. Deze helpen ook bij het bewerken van de chromatines. Een andere barrière dat de verlengende factoren moeten overbruggen, is het DNA super draaien. Dit brengt extra spanning op de dubbele helix. De helix kan in een negatief of een positief geladen spiraal gedraaid zijn. De negatief geladen spiraal is makkelijker te openen ten opzichte van de positief geladen spiraal.

Vervolgens wordt het DNA nog bewerkt, zoals bij RNA splicing, capping en polyadenylatie. Het capping gebeurt door drie enzymen: 1) een enzym verwijdert een fosfaatgroep aan het 5’ einde, 2) een enzym voegt een guanosine molecuul toe in de 5’-5’ richting en 3) een enzym voegt een methylgroep toe aan de guanosine. Het capping is nodig ter bescherming, ter herkenning van RNA moleculen en ter gebruik voor translatie.

Eukaryotische DNA bestaat uit eiwit coderende genen, exonen, en uit niet coderende genen, intronen. Beiden, exonen en intronen, worden vertaald in RNA, maar alleen de exonen halen het mRNA, omdat de intronen eruit worden geknipt door DNA splicing. De intronen worden eruit geknipt door sequentie fosforyl transfer reacties (transesterificaties). Dit gebeurt zeer accuraat met vele eiwitten en vijf extra RNA moleculen. Als we de intronen toch verwijderen, waarom hebben we ze dan? De wetenschappers denken dat het komt, omdat in de lange termijn intronen en coderende genen gecombineerd kunnen worden om de evolutie te overleven. Daarnaast zorgt RNA splicing ervoor dat er meer verschillende genen gecodeerd kunnen worden. RNA splicing heeft drie ‘signaalsequenties’ nodig om te functioneren: 1) de 5’ knipplaats, 2) de 3’ knipplaats en 3) de intron sequentie van de ‘branch-point’ plaats. Het knippen gebeurt door het spliceosoom. Dit complex is opgebouwd uit vijf snRNA’s (small nuclear RNAs; U1, U2, U4, U5 en U6) en deze zijn weer opgebouwd uit ten minste zeven eiwit subunits (snRNPs). Het spliceosoom gebruikt ATP hydrolyse om nieuwe RNA-RNA (exonen aan elkaar) sequenties te vormen. De juiste knipplaatsen worden gevonden, omdat de fosforstaart van RNA polymerase 2 verschillende componenten van het spliceosoom meeneemt. Hierdoor is er een directe mogelijkheid om het spliceosoom op te bouwen. Exon definitie is een andere strategie, waarbij de 3’ en 5’ uiteindes worden gedefinieerd.

Eukaryoten hebben een extra paar snRNPs: het U12-type spliceosoom. Dit splitst een klein gedeelte van de intronen, is langzamer en maakt andere overeenkomende intronsequenties dan het bovenstaande spliceosoom. Een derde vorm van RNA splicing wordt gedaan door trans splicing. Dit komt niet voor bij mensen, maar wel bij enkel-celligen en voegt twee exonen aan elkaar.

RNA splicing is plastisch, omdat het verandert kan worden door een mutatie en omdat het patroon van knippen gereguleerd kan worden. Door een mutatie wordt niet alles gestopt, maar delen worden eruit geknipt en sommige delen gewoon overgeslagen.

De wetenschappers vonden het RNA splicing tamelijk ingewikkeld en begrepen niet waarom het zo ingewikkeld moest zijn. Dit ligt waarschijnlijk aan de origine van RNA splicing. Ze denken dat RNA voor DNA bestond en dat er daarvoor zelf-splicing technieken nodig waren die zelfstandig konden functioneren. Er zijn twee klassen zelf-splicing: 1) groep 1 intron sequenties gebruiken een G nucleotide op het intron dat de aanval inzet samen met andere eiwitten en 2) group 2 intron sequenties gebruiken een reactief A residu samen met een aanvalsgroep om een lariat te vormen.

Het 5’ einde wordt beschermd door een kapje en het 3’ einde wordt beschermd door de CstF en CPSF eiwit multiunits, die meereizen met de polymerase staart. Deze roepen eiwitten en enzymen op, zoals het poly-A polymerase enzym (PAP) dat 200 A nucleotides aan het einde vast maakt. Wanneer RNA zijn 5’ kapje, exon samenvoeging en zijn poly-A additie heeft, is het een volwassen RNA molecuul en kan het getransporteerd worden uit de celkern. Ook wanneer RNA moleculen bepaalde eiwitten, zoals snRNP’s, mist, dan is het duidelijk dat het een volwassen RNA molecuul is. De overgebleven en onvolwassen RNA moleculen worden afgebroken door het exosoom. Dit bestaat uit 3’-5’ RNA exonucleases. De RNA moleculen worden actief verplaatst door ‘nuclear pore complexes’ (NPC) in het cytosol buiten de celkern. Ze worden geholpen door kern transport receptoren die aan hen binden en weer loslaten als ze buiten de kern zijn.

Naast het maken van RNA dat codeert voor genen, worden er ook niet coderende RNA moleculen gemaakt in de celkern. Er bestaan meerdere rRNA genen die coderen voor rRNA. Er zijn vier soorten rRNA; drie daarvan, 18S, 5.8S en 28S, worden gevormd uit chemische bewerkingen en splicing. De vierde, 5S, wordt gemaakt door aparte genen, en polymerase 3, en heeft geen bewerking meer nodig. De RNA moleculen die helpen bij het knippen van rRNA molecolen zijn small nucleolar RNAs (snoRNAs). Deze worden aangemaakt in intronen en in een subcompartiment in de celkern. Dit is de nucleolus, heeft geen membraan en bevat alles om ribosomen te maken. Tijdens de metafase en anafase is de nucleolus niet te zien, omdat op dat moment alles helemaal verspreidt ligt in de cel.

Naast de nucleolus, zijn er nog andere organellen in de celkern. Dit zijn de Cajal lichamen, GEMS en interchromatine granule clusters. Zij hebben ook geen membraan en blijven bij elkaar door de hoge concentraties en omdat ze elkaar veel nodig hebben. Cajal lichamen en GEMS zijn locaties waar snoRNA’s en snRNA’s covalente bewerkingen ondergaan en waar de laatste samenvoeging met eiwitten is. Small Cajal RNA’s (scaRNAs) selecteren de plekken waar deze bewerkingen gedaan worden. Interchromatine granule clusters verzamelen waarschijnlijk volwassen snRNP’s en andere RNA bewerkende moleculen.

Van RNA naar eiwit

Het proces waarbij RNA in een eiwit wordt vertaald, wordt translatie genoemd. De genetische code van basen wordt vertaald in aminozuren en vervolgens in eiwitten. Elke drieletterwoorden, codons, van basen worden omgezet in aminozuren. Er zijn meerdere codons die voor een aminozuur coderen (overtolligheid). Een RNA molecuul kan vertaald worden in drie verschillende leeskaders. Het ligt er maar net aan waar het lezen begint.

Er zijn adaptoren die helpen bij het samenbrengen van codons en bijbehorende aminozuren. Deze adaptoren zijn transfer RNA (tRNA) moleculen en bevatten twee bindingsplaatsen: eentje voor het codon (anticodon) en de andere voor een aminozuur. Voordat tRNA’s de celkern verlaten, worden ze covalent bewerkt en gemaakt door polymerase 3. De pre-cursor tRNA wordt getrimd door eiwitten

Aminoacyl-tRNA synthetases zorgen ervoor dat de aminozuren herkend worden en aan hun eigen tRNA molecuul worden gebonden. Elk aminozuur heeft zijn eigen tRNA molecuul. Er is een tweede enzym dat een verkeerd aminozuur bewerkt zodat het wel bij zijn anticodon hoort op het tRNA molecuul. Hierdoor ontstaan er minder fouten. Dit wordt gedaan door het selecteren van de correcte aminozuur in twee stappen: 1) de correcte aminozuur heeft de hoogste affiniteit voor zijn synthesase en 2) wanneer een verkeerd aminozuur binnendringt wordt deze gelinkt aan AMP en later door middel van hydrolyse verwijderd van de AMP.

Aminozuren binden aan elkaar vast door de aminogroep van het aankomende aminozuur, te binden van het C-atoom van het vorige aminozuur (N-terminal richting C-terminal). Hierbij voorziet het vorige aminozuur de energie voor het aankomende aminozuur.

Een ribosoom is een katalytische machine dat bestaat uit vijftig verschillende eiwitten en rRNA’s. Het is een machine dat codons vertaald in aminozuren en deze vervolgens aan elkaar bindt, zodat er eiwitten ontstaan. Ze bevinden zich in het cytoplasma en worden gemaakt in de nucleolus. De bacteriële en eukaryotische ribosomen lijken veel op elkaar en hebben allebei een grote en een kleine unit. De kleine unit bindt de tRNA’s en de grote unit bindt de aminozuren aan elkaar. De mRNA’s komen binnen samen met de tRNA’s die ook de aminozuren meebrengen. Het mRNA wordt als een draad erdoor heen getrokken. Het tRNA houdt de codons gelijk met de mRNA basen en komt terecht op drie plaatsen: 1) de A-plaats waar de tRNA’s binnenkomen, 2) de P-plaats waar de aminozurenketting gevormd wordt en 3) de E-plaats voor exit van de tRNA’s. Door het mRNA worden de tRNA’s op de A- en P-plaatsen ‘vastgebonden’.

De twee verlengende factoren (EF-Tu en EF-G bij bacteriën en EF1 en EF2 bij eukaryoten) hydrolyseren GTP tot GDP. Deze factoren zorgen ervoor dat er minder fouten gemaakt worden. Dit wordt gedaan op de volgende manier:

·         EF-Tu kijkt of een binnenkomend aminoacyl-tRNA het juiste aminozuur draagt.

·         Ook zorgt EF-Tu voor het eerste contact tussen het mRNA en het anticodon.

·         Wanneer het goede aminozuur gebonden is, verandert GTP in GDP waardoor EF-Tu loslaat en het aminozuur afgestaan kan worden aan de groeiende ketting.

·         Een andere manier voor het detecteren is de tijd dat een tRNA neemt voor het plaats nemen op een positie. De incorrecte gebonden aminozuren doen hier langer over en worden niet toegelaten. Bovendien binden ze minder sterk aan het mRNA.

Een ribosoom is het bewijs voor het eerdere gebruik van RNA dan DNA, omdat het voornamelijk bestaat uit RNA en voornamelijk gebruik maakt van RNA. De 23S rRNA vormt een soort zakje dat gebruik maakt van waterstofbindingen om de groeiende peptide ketting en een aminoacyl-tRNA te oriënteren. Hierdoor versnelt hun covalente binding. Daarnaast geeft de P-plaats een OH-groep dat helpt bij de katalysatie.

De RNA moleculen, de moleculen die katalytische activiteit vertonen, zijn ribozymen. Deze zorgen voor zelf-splicing, maar ook voor meer reacties. MRNA nucleotide sequenties geven een teken waar de eiwitsynthese moet beginnen. Deze tekens zijn het codon AUG en een initatie tRNA dat altijd methionine draagt. Het initiatie tRNA wordt geholpen door extra eiwitten, genaamd eukaryotische initiatie factoren (eIF’s). Vervolgens bindt het kleine ribosoom stuk aan de 5’ eind kap van het mRNA en zoekt naar de eerste AUG sequentie. Soms worden de eerste AUG sequenties overgeslagen, waardoor er andere eiwitten ontstaan. In plaats van een 5’ eind kapje, hebben bacteriën een speciale ribosoom bindingssequentie: de Shine-Dalgarno sequentie.

Een stopcodon geeft het einde van een sequentie en eiwit aan (UAA, UAG of UGA). Door dit signaal wordt de C-terminaal losgelaten door het ribosoom. Tijdens het vertalen wordt het eiwit door een tunnel gehaald, waar mogelijk al een vorm in komt, maar de echte structuur van het eiwit vormt zich pas na de ribosomale actie.

Het mRNA gaat door ongeveer 80 ribosomen tegelijk die met zijn allen aparte eiwitten vormen. Hierdoor worden er zeer snel veel eiwitten geproduceerd. Variatie in de aminozurenketting kan veroorzaakt worden door translatie recodering. Hierbij zit er een andere nucleotide sequentie in het mRNA dat de genetische code verandert. Translationele kaderverandering veroorzaakt de aanmaak van meerdere eiwitten van één stukje mRNA.

Remmende factoren voor de eiwitsynthese van prokaryoten worden gebruikt als antibiotica.

De precisie tijdens translatie heeft vrije energie nodig. Toch is het voordeliger voor een cel om alle correcte aminozuren en mRNA moleculen goed te binden, omdat dat minder energie kost dan het repareren ervan als het niet correct gebonden is. Soms worden er ook nog beschadigde mRNA moleculen in het cytoplasma gebracht, ondanks de controle qua 5’ eind kap, poly-A staart en de exon samenvoeging. Hier heeft de cel nog een laatste redding voor: nonsense medieer mRNA afbraak. Dit breekt beschadigde eiwitten af door het detecteren van stopcodons op de verkeerde plaatsen. De detectie vindt plaats tijdens het vertalen en wordt afgebroken als er een stopcodon gevonden wordt, terwijl er nog mRNA over is. Dit mechanisme zorgt er ook voor dat bepaalde ziektes ontstaan. De genen die coderen voor de benodigde eiwitten zijn kapot waardoor ze ook niet goed vertaald kunnen worden.

Als alles vertaald is, is er een eiwit, maar dit eiwit heeft nog niet de goede structuur. Deze wordt gevormd door bindingen aan te gaan die de minste energie kosten. De secundaire structuren binden als eerst en later ontstaan de tertiaire structuren met behulp van molten globule. Het vouwen wordt geholpen door moleculaire chaperones. Voorbeelden zijn Hsp60 en Hsp70 en deze werken met hun eigen eiwitten om de eiwitten te vouwen. Het Hsp70 helpt als eerste en Hsp60 komt later te pas. Een eiwit dat niet goed gevouwen is, kan gevaarlijk zijn, omdat het bepaalde ziektes veroorzaakt. Een eiwit dat (nog) niet de goede vorm heeft aangenomen, is te herkennen aan een hydrofoob gebied op het oppervlakte van het eiwit. Deze worden geholpen om goed te vormen door onder andere Hsp60 en Hsp70. Als het opnieuw vouwen van een eiwit niet lukt of het duurt te lang, dan wordt het afgebroken door het proteasoom. Het proteasoom maakt gebruik van ATP om de protease uit te voeren. Het proteasoom wordt geholpen door het endoplasmatisch reticulum (ER). Wanneer het ER een fout eiwit vindt, wordt het verzonden naar het cytosol voor afbraak. Het proteasoom is een cilinder met aan beide zijden eiwitcomplexen. Deze complexen (19S kap) geven het foute eiwit door aan de kern van het proteasoom waar het wordt afgebroken. Terwijl dit doorgeven gebeurt, wordt het eiwit door ATP hydrolyse ontrafelt. Dit wordt gedaan door ‘ontrafeldases’, of AAA eiwitten. Opvallend bij het proteasoom is het verwerken van het eiwit, want het eiwit wordt bij elkaar gehouden en in kleine peptides geknipt.

Het foute eiwit wordt ook herkend door het gebonden ubiquitin en door de 19S kap naar binnen gelaten. Het aantal unibiquitin moleculen bepalen het lot van dat eiwit. Voor de afbraak van een eiwit is een heel complex van unibiquitin moleculen nodig. Het ubiquitin-activatie enzym is ATP afhankelijk en activeert het E1-bindings ubiquitin. Deze wordt getransporteerd richting ubiquitin-conjuctie (E2) enzymen, waarna deze samen werken met E3 eiwitten. Het E2-E3 complex wordt ubiquitin ligse genoemd. De E3 bindt aan degrons (afbraak signalen), waardoor E2 een polyubiquitin ketting kan vormen. De C-terminaal is gebonden aan het vorige unibiquitin molecuul of speciale lysine moleculen. Het proteasoom herkend helaas niet altijd goede en foute eiwitten, conformaties of groeiende aminozuurkettingen, omdat volwassen eiwitten soms hun degradatie signalen tijdelijk naar buiten richten.

De proteolytische manier wordt ook gebruikt voor andere doeleinden. Wanneer een concentratie te hoog is van een bepaald eiwit, worden deze afgebroken door protease. Dit kan kort of lang duren. Deze wijze van gereguleerde afbraak, wordt geregeld door ubiquitin ligase. De ligase wordt geactiviteerd door de fosforlisatie van E3 of door een allosterische verandering van E3. Ook kan een eiwit zelf een degradatie signaal afgeven. Dit doet het eiwit door een specifieke plaats te fosforliseren, waardoor een verstopt degradatie signaal tevoorschijn komt. Een andere ‘zelf’ degradatie signaal is het afknippen van een peptide binding, zodat er een onstabiel residu bij de N-terminaal ontstaat. Daarnaast kunnen fout gevouwen eiwitten verzamelen, waardoor er ziektes ontstaan. De foute eiwitten komen dan door de barrières van de cel heen. Ze vormen kruisbèta filamenten die resistent zijn tegen proteolyse. Deze zorgen voor de ophoping van amyloïdes. De meeste ziektes worden doorgegeven of begonnen in een organisme, maar sommige ziektes worden horizontaal doorgegeven. Dit zijn prion ziektes en worden veroorzaakt door een fout gevouwen, verzamelde vorm van een PrP eiwit.

De RNA wereld en de herkomst des levens

DNA is afhankelijk van eiwitten en eiwitten zijn afhankelijk van DNA. Om deze reden denken de wetenschappers dat er iets moet zijn voor dit alles: RNA. Dit wordt gesteld in de RNA wereld hypothese. Er moet volgens hun RNA zijn geweest dat genetisch materiaal opsloeg en reacties kon katalyseren. In dit stuk zullen er enige argumenten gebruikt worden om deze stelling te ondersteunen.

Leven heeft opgeslagen informatie nodig om de juiste reacties uit te voeren. Ook moet dit te verdubbelen zijn om door te geven aan nakomelingen. Daarnaast moet dit variabel zijn, zodat er overleefd kan worden en er diversiteit ontstaat. En uiteraard moet het katalyseren zodat er reacties uitgevoerd kunnen worden. Polypeptides kunnen informatie dragen, door de volgorde van aminozuren, en kunnen katalyseren. Deze kunnen alleen niet hun informatie kopiëren, dat kunnen polynucleotides wel zelf. Ook kunnen polynucleotides chemische reacties katalyseren. De eigenschappen die nodig zijn, heeft RNA, behalve het zelf kopiëren van de informatie. Het wordt nog onderzocht of dit mogelijk is. Aangezien RNA lange polypeptides en katalisten nodig heeft voor bepaalde reacties, wordt er gedacht dat er een pre-RNA wereld is. Dit stelt RNA voor, maar dan simpeler en vervolgens is er een transitie gemaakt naar RNA. Er zijn RNA structuren die bestaan uit kleine, herhalende sequenties. Deze structuren kunnen samenwerken om reacties te katalyseren. RNA moleculen met allemaal andere functies kunnen samenwerken om te overleven. Toch zijn deze gevoelig om aangevallen te worden, waardoor compartimentalisatie optrad. Het begon met kleine en simpele oppervlakten van deeltjes. Later kwamen de amfibilische dubbellaag membranen. Het is voor wetenschappers moeilijk te begrijpen waarom eiwitten zijn ontstaan, terwijl RNA moleculen ‘alles’ konden uitvoeren. Tegenwoordig zijn dit systemen die niet meer zonder elkaar kunnen. Men denkt dat RNA moleculen als template hebben gediend voor aminozuren, waarna eiwitten de kans kregen om te evolueren. Tegenwoordig gebruiken alle organismen en cellen DNA als hun erfelijk materiaal.

7. De controle van gen expressie

De regels en verschillende mechanismen om gen expressie in bedwang te houden, worden in dit hoofdstuk besproken.

Een overzicht van gen controle

De determinatie van een cel, welke soort en functie een cel krijgt, wordt bepaald door veranderingen in de gen expressie en niet per se de nucleotide sequentie. Elke cel begint met hetzelfde genoom en krijgt op een gegeven moment een signaal voor de determinatie. Er zijn al verschillende onderzoeken geweest waarbij genomen in eitjes, gereconstrueerde zygoten, worden geplaatst. Hieruit kwamen gezonde dieren.

Om differentiatie tussen cellen te begrijpen, zijn er eerst een paar punten die bekend zijn over cellen. Cellen hebben vele eiwitten hetzelfde, eiwitten zoals chromosomen, RNA polymerases, DNA herstel enzymen, ribosomale eiwitten, metabolisme enzymen en cytoskelet eiwitten. Sommige eiwitten zijn in overvloed bij cellen met bepaalde functies en juist bij andere cellen totaal niet te vinden. Daarnaast is de hoeveelheid RNA voor bepaalde genen anders per cel. MRNA zorgt niet alleen voor de diversiteit aan genen, maar ook posttranscriptionele factoren helpen daarbij.

De gen expressie kan verandert worden door signalen uit de omgeving en buitenaf. Daarnaast wordt gen expressie gereguleerd tijdens het proces waarbij DNA genen RNA maken en vervolgens wordt vertaald in eiwitten. Dit kan op zes verschillende manieren:

1.      Transcriptionele controle: de mate waarin een gen gekopieerd wordt.

2.      RNA proces controle: de mate waarin het knippen en verwerken van RNA transcripten gereguleerd worden.

3.      RNA transport en localisatie controle: de selectie waar mRNA moleculen getransporteerd worden richting en waar in het cytosol.

4.      Translationele controle: de selectie van mRNA moleculen die vertaald mogen worden door ribosomen.

5.      mRNA degradatie controle: selectieve afbraak van mRNA moleculen in het cytoplasma.

6.      Eiwit activiteit controle: de selectieve activatie, de inactivatie, de afbraak of het lokaliseren van eiwitten.

DNA bindingsmotieven in gen regulerende eiwitten

Er zijn simpele, enkele eiwitten die gen expressie reguleren, maar ook grote en complexe eiwitten. Er zijn echter twee onderdelen die hiervoor noodzakelijk zijn: 1) kleine DNA sequenties en 2) gen regulerende eiwitten die de DNA sequenties herkennen en zich hier vervolgens aan bindt. De laatst genoemde eiwitten zijn een soort schakelaars die genen aan of uit zetten. Ook wel transcriptie factoren genoemd. De Lac repressor is een bacterieel eiwit dat de productie van lactose metabolisme eiwitten reguleert, wanneer er geen suiker aanwezig is.

De buitenkant van de helix kan gelezen worden door eiwitten. Deze eiwitten kijken naar de kleine en grote groeven in de helix. Dit wordt veroorzaakt door de waterstof bindende donoren, acceptoren en hydrofobische gedeeltes. De grote groeven maken duidelijk onderscheidt tussen de verschillende baseparen en deze worden daarom veel gebruikt.

Van de kleine DNA sequenties zijn er duizenden. Deze horen allemaal bij een specifiek gen regulerend eiwit. Deze DNA sequenties zijn, zoals eerder genoemd, essentieel voor het aan en uitzetten van genen.

De specifieke DNA sequenties worden herkend door de gen regulerende eiwitten, omdat de oppervlakten van dat eiwit en de dubbele helix complementair zijn. Het eiwit bindt hier aan vast met vele bindingen. Daarnaast bevat het eiwit motieven, zoals een alpha helix of een beta blad, om de DNA sequenties te lezen. Het meest voorkomende motief is de helix-draai-helix. Het is gevormd uit twee helixen en een korte aminozuur ketting (draai). De herkenningshelix, C-terminaal helix, past in de grote groeve waarna de aminozuren herkennen waar het eiwit moet binden. In een fruitvliegje zitten homeotische selectie genen die helpen bij de opbouw van het organisme. Dit soorten eiwitten zijn ook gevonden in andere organismen en bevatten bijna dezelfde sequenties en aminozuren. Dit wordt aangeduid met het homeodomein en bevat een helix-draai-helix motief.

Een ander belangrijk motief is het zink vingers motief en bevatten veel zink-moleculen. Er zijn twee typen zink vingers motieven: 1) een zink vingers motief bevat een alpha helix en een beta blad en 2) is gevonden in intracellulaire receptor eiwitten die twee alpha helixen bevat en daar tussen in een zinkatomen. Meestal zijn het alpha helixen die de DNA sequenties herkennen, maar een twee stengig beta blad, opgebouwd uit aminozuren, kan dit ook. Andere eiwitten gebruiken geen motieven, maar lussen om de grote en de kleine groeven te kunnen herkennen (bijvoorbeeld een tumor suppressor).

Er is nog een ander motief: het leucine rits motief. Dit motief bestaat uit twee alpha helixen in elkaar gedraaid en aan beide uiteindes zitten aminozuren, voornamelijk leucine moleculen. Tijdens de dimerisatie gaan de helixen uit elkaar, Y-structuur, waarna de kant kettingen bij de grote groeve kan.

Bovenstaande dimeren zijn allemaal opgebouwd uit twee identieke untis (homodimeren). Wanneer er heterodimeren worden gebruikt, kunnen er meerdere DNA sequenties gelezen worden door de gen regulerende eiwitten. Hier kunnen niet alle soorten eiwitten met elkaar gecombineerd worden, anders zou er chaos ontstaan. Daarom is er sprake van combinationele controle waarbij er een aantal combinaties kunnen gemaakt worden met verschillende eiwitten.

Vervolgens is er nog een ander motief: het helix-lus-helix motief. Dit motief is anders dan het helix-draai-helix motief, omdat het een lus bevat dat voor flexibilteit tussen de helixen zorgt. Het helix-lus-helix motief kan paren met een andere helix-lus-helix motief, dit kan met hetzelfde motief (homodimeer) of een ander motief (heterodimeer).

De sequenties die deze gen regulerende eiwitten herkennen, zijn nog niet bekend. Het is al duidelijk dat sommige sequenties vaker voorkomen. Wetenschappers zijn bezig om hier achter te komen. Dit doen ze met behulp van een gel-mobiliteits shift assay. Deze techniek laat verschillende sequentie lengtes door een gel heen lopen op basis van elektroforese. DNA is negatief geladen en wordt door de gel naar de positieve pool getrokken.

Een andere methode is DNA affiniteit chromatografie en kan gebruikt worden als een DNA sequentie bekend is dat door een gen regulerend eiwit herkend wordt. Hierbij wordt het eiwit gezuiverd en versterkt. Verder kan een DNA sequentie, herkend door gen regulerende eiwitten, experimenteel bepaald worden. De sequenties worden bekend door het isoleren van mutaties. DNA footprinting wordt gedaan met gezuiverde eiwitten om de DNA sequentie te bepalen. Een andere methode is om een gezuiverd gen regulerend eiwit in een zee van DNA sequenties te stoppen. Vervolgens kan er gezien worden welke sequentie aan het eiwit bindt en daarbij hoort. Helaas is deze methode niet waterproef, omdat er meerdere en gelijke soort DNA sequenties herkend worden.

Een volgende methode is fylogenetische footprinting. Hierbij worden genomen vergeleken tussen organismen. De gen regulerende eiwitten zijn al zeer oud en deze herkennen de goed behouden DNA sequenties.

Een methode om de plaatsen op het DNA te vinden die gebruikt worden door gen regulerende eiwitten is chromatine immunoprecipitatie. Hierbij worden eiwitten gekruist met DNA en wordt het DNA in kleine fragmenten gedeeld. Vervolgens worden er antilichamen gebruikt om de gen regulerende eiwitten te vinden, die nog steeds vastzitten aan het DNA dat gevonden moest worden.

Hoe genetische schakelaars werken

Genetische schakelaars bevatten twee componenten die hierboven zijn beschreven: de DNA sequenties die herkend worden door de gen regulerende eiwitten. In dit stuk wordt er gekeken hoe deze schakelaars aan en uit worden gezet.

Er zijn genen die coderen voor eiwitten, als er bepaalde stoffen in de omgeving wel of niet aanwezig zijn. Een voorbeeld hiervan is de tryptofaan repressor. Deze genen zijn gerangschikt als één operon: naast elkaar gelegen genen die door één promoter gekopieerd worden. Wanneer tryptofaan in de omgeving voorkomt, zijn deze genen niet meer nodig en wordt het gen uitgezet. De promoter bevat een operator; dit is een gen regulerend element. Deze sequentie wordt herkend door een regulerende DNA sequentie en in dit geval is dat de tryptofaan repressor.

Wanneer genen worden uitgeschakeld, door transcriptionele onderdrukkers of gen repressor eiwitten, heet dat een negatieve controle. Wanneer er moeite is om de transcriptie te beginnen, mogelijk door heterochromatines, dan zijn er gen regulerende eiwitten die bekend staan als transcriptionele activatoren of gen activator eiwitten. Zij zorgen er juist voor dat transcriptie begint (positieve controle). De tryptofaan onderdrukkers en de transcriptionele activator CAP (wordt geactiveerd als er geen glucose is) gebruiken beide een helix-draai-helix motief. Het CAP eiwit brengt het Lac operon in gang, wanneer er geen glucose is, maar wel lactose.

Tijdens bacteriële gen regulatie vindt er looping plaats. Het Lac operon bevat meerdere operatoren zodat een tetramerisch molecuul twee operatoren kan binden, waardoor een lus van DNA ontstaat.  Dit gebeurt ook bij eukaryoten. Naast het vormen van een lus, gebruiken bacteriën de, al eerder genoemde, sigma factoren. Deze reguleren genen door ze bezet te houden en wanneer een gen nodig is, verplaatsen ze zich en kunnen ze een ander gen blokkeren. Er zijn vele genen die voor sigma factoren coderen wat inhoudt dat ze zeer belangrijk zijn. Ze zijn ook slim, want ze kunnen individuele genen aan en uitschakelen in een heel groot systeem.

Eukaryoten hebben een groter genoom en daarom ook meerdere signalen nodig om genen aan of uit te zetten. RNA polymerase 2 heeft vijf algemene transcriptie factoren nodig en bacteriën maar eentje. Eukaryoten missen operons en reguleren elk gen individueel. Ook hebben ze veel meer regulerende eiwitten die over grote afstanden signalen af kunnen geven. Daarnaast bevatten eukaryoten de Mediator (medieert tussen gen regulerende eiwitten en RNA polymerase) en uiteraard de chromatines die het DNA inpakken.

Een gebied dat lange stukken DNA reguleert, wordt een gen controle gebied genoemd. Het bevat ook de promoter dat de algemene transcriptie factoren en de polymerase samenstelt. Uiteraard bevat het ook al de regulerende sequenties waar de gen regulerende eiwitten aan binden. De activatoren werden eerst ‘enhancers’ genoemd, omdat ze helpen om de transcriptie te versnellen. Het eerste domein op een eiwit wordt gezien als het begin en bevat een bovenstaand motief dat DNA sequenties herkend. Het volgende domein is het activatie domein. De activator eiwitten zorgen voor de opbouw van de algemene transcriptie factoren en de RNA polymerase. Vervolgens worden er histon bewerkingsenzymen, chromatine remodeleringscomplexen en histon chaperonen opgeroepen om de chromatine structuur te veranderen, verwijderen, vervangen of de histonen te bewerken. Hierdoor kan polymerase 2 bij het DNA. Acetylgroepen worden toegevoegd aan de  nucleosomen, die voor polymerase 2 liggen. Vervolgens verwijderd en achter polymerase 2 gezet. Daarna worden de acetylgroepen weggehaald en methygroepen toegevoegd, zodat er niet snel weer transcriptie kan beginnen.

Wanneer meer eiwitten samenwerken om de activatie energie lager krijgen, dit kan ook apart van elkaar zijn, wordt dit transcriptionele synergie genoemd. Hierdoor wordt de energie een stuk lager dan wanneer de eiwitten dit alleen doen.

Gen repressor eiwitten zorgen ervoor dat genen niet gekopieerd worden. Deze eiwitten hebben verschillende mechanismen om hun doel te volbrengen. Veel gen regulerende eiwitten in eukaryoten werken vaak samen en binden samen aan het DNA. De DNA sequentie kan de transcriptie beïnvloeden, omdat de structuur van het regulerende eiwit verandert bij een bepaalde DNA sequentie. Op deze manier kan de replicatie wel of niet beginnen. Ook begint de transcriptie pas als alle juist DNA sequenties aanwezig zijn om herkend te worden door gen regulerende eiwitten.

Drosophila, fruitvliegje, bevat genetische schakelaars die de ontwikkeling van het vliegje regelen. Deze bestaan uit kleinere onderdelen. Een voorbeeld van zo een schakelaar is het Drosophila Even-skipped (Eve) gen. Als deze ontbreekt of inactief is door een mutatie, mist het embryo onderdelen. Als het aanwezig is, zorgt het gen voor een grote cel met meerdere kernen dat voor verschillende delen in het embryo codeert. De kernen worden verschillende onderdelen, omdat ze blootgesteld worden aan meerdere gen regulerende eiwitten. Het Eve gen is een groot gen, 20.000 nucleotide paren, en bereikt een groot gebied. Het gen wordt gereguleerd door combinationele controles: Bicoid en Hunchback activeren het gen en Krüppel en Giant onderdrukken het gen. Het gen gebruikt heterodimerisatie van gen regulerende eiwitten en de samenstellingen van combinaties van gen regulerende eiwitten. Het gen gebruikt zelfs nog een derde type combinatie controle: doordat het Eve gen zo groot is, heeft het vele plekken waar gen regulerende eiwitten kunnen binden. De complexe gen controle gebieden bij zoogdieren, worden ook gemaakt uit simpele regulerende onderdelen. Om signalen tegen te houden die anders te ver over het genoom worden verspreidt, worden er insulatoren gebruikt.

De genetische mechanismen op moleculair niveau die speciale cel typen maakt

Nieuwe cellen onthouden wat hun voorouderlijke cellen zijn geweest (celgeheugen). Dit is de eerste vereiste voor het behouden van verschillende cellen. Andere veranderingen in de cellen zijn kortstondig. Denk hierbij aan de schakelaars die geen ‘geheugen’ hebben.

Fase variatie komt in bacteriën voor en het zorgt ervoor dat DNA sequenties op verschillende manieren gelezen kan worden. Een voorbeeld is de schakelaar in de Salmonella bacterie; hierin bestaat een 1000 nucleotide lange sequentie dat door één promoter de ene kant op wordt gelezen en door een andere promoter de andere kant op. Dit zorgt ervoor dat een sequentie voor twee verschillende eiwitten codeert. Wanneer een gastheercel antilichamen maakt tegen het ene eiwit, wordt het andere eiwit actief gesteld.

Gist is een eencellige eukaryoot en haploïde, maar tijdens het paren worden twee cellen toegevoegd en zijn ze diploïde. Als ze willen paren moeten ze allebei een andere ‘sekse’ hebben: a en alpha. De verschillende sekse worden bepaald op het parings-type (Mat) locus. Het a-type codeert voor Mata1 en het alpha-type codeert voor Matalpha1 (transcriptionele activator voor het alpha type) en Matalpha2 (transcriptionele onderdrukker voor a). Meestal zijn de gist-cellen één seks-type, maar sommigen kunnen ook veranderen van sekse. Hier wordt het actieve Mat-type locus vervangen door een stil Mat-type (cassette mechanisme), maar het vorige type blijft wel in het genoom en kan zijn oude plek terug nemen.

De bovenstaande omkeerbare DNA sequenties zijn nog niet gevonden in eukaryoten. De bacteriofaag lambda kan twee vormen aannemen, waarbij het genoom op twee verschillende manieren gelezen wordt. Hierbij zorgt de bacteriofaag ervoor dat alleen het integrase eiwit gemaakt wordt en niet de genen die de gastheercel dood maken. Het lambda repressor eiwit en het Cro eiwit concurreren met elkaar, onderdrukken elkaar, om de bacteriofaag in een bepaalde staat te krijgen. In staat 1 (profaag staat) wordt de operator bezet gehouden zodat de synthese van het Cro eiwit niet kan beginnen. In staat 2 (lytische staat) houdt het Cro eiwit een ander deel van de operator bezet, zodat het wel nog zijn eigen synthese kan beginnen. Doordat de bacteriofaag gebruik maakt van feedback signalen, ontstaat er een strategie voor celgeheugen. Daarnaast worden de feedback signalen gebruikt om een transcriptie circuit te vormen, zodat er logische stappen worden gemaakt. Een feed-forward circuit gebruikt alleen de langere signalen en niet de korte signalen. De eukaryotische feedback circuits zijn een stuk complexer en groter.

De bovenstaande, en andere, systemen worden nagemaakt om te zien of ze begrepen zijn en om te kijken of ze ergens voor kunnen dienen. Het circadiaan ritme is een biologisch ritme dat ongeveer 24 uur duurt. Dit ritme krijgt feedback signalen uit de omgeving en zo kan een organisme de omgeving gebruiken om de meest voordelige acties op dat moment uit te voeren. Een belangrijk onderdeel van een zoogdier zijn de SCN cellen (suprachiasmatich of the hypothalamus); voor lichaamstemperatuur, hormonen en dag/nacht ritme. Daarnaast zijn er nog meer systemen in verschillende organismen.

Bacteriën reguleren hun genen door middel van operons. Hierbij codeert een promoter voor een aantal eiwitten. Bij eukaryoten codeert elke promoter voor een ander gen. De genen worden gereguleerd door combinationele factoren en genen worden actief of inactief gesteld door het maximale uit die factoren te halen. Een voorbeeld hiervan is het glucocorticoïde receptor eiwit. Wanneer mensen energie nodig hebben tijdens langdurige beweging wordt het hormoon cortisol afgegeven. Deze activeert de aanmaak van glucose in de lever. Wanneer genoeg glucose is geproduceerd, houden ook de signalen van het cortisol op.

De expressie van een belangrijk gen regulerend eiwit kan zorgen voor de expressie van vele genen. Genen kunnen verschillende receptoren bevatten die door dit gen aangezet kunnen worden. Deze genen coderen voor dezelfde of andere eigenschappen voor cellen. Vele combinationele genen kunnen in eukaryoten veel verschillende celtypen starten. De combinationele genen reageren anders in verschillende omgevingen. Daarnaast moeten deze genen omgaan met andere gen regulerende eiwitten, transcriptie factoren, polymerases et cetera. Als er een nieuw gen regulerend eiwit ontstaat, ligt het aan de geschiedenis of dat gen goed opgenomen kan worden in het systeem.

Ook kan een enkel gen regulerend eiwit de formatie van een heel orgaan in gang zetten. Een voorbeeld hiervan is het Drosophila oog dat op benen kan groeien. Het gen regulerend eiwit, Ey, zorgt voor de expressie van andere genen door aan hun regulerende gebieden te binden. Deze gebieden kunnen positieve feedback geven aan Ey zodat dit eiwit blijft doorwerken.

Covalente bindingen kunnen gen expressie reguleren en dit wordt gedaan door DNA methylatie. Aan cytosine komt een methylgroep te zitten. Dit patroon kan doorgegeven worden aan de dochtercellen, omdat het enzym ‘onderhoud methyltransferase’ reageert op de CG sequenties die met gemethyliseerde CG sequenties paren. Dit gebeurt uiteraard ook tijdens de replicatie, waardoor de template streng met sommige gemethyliseerde CG sequenties overgenomen worden op de nieuwe streng. Er kunnen ook nieuwe patronen ontwikkeld worden door de novo DNA methyltransferases.

Een ander verschijnsel dat afhankelijk is van DNA methylisatie is genomische imprinting. Zoogdieren zijn diploïde en wanneer bepaalde genen van de vader gebruikt worden en de moeder inactief zijn, wordt dat genomische imprinting genoemd. Genen worden gemethyliseerd om te herkennen waar die genen vandaan kwamen en of ze deze wel of niet moeten gebruiken. Als deaminatie plaatsvindt bij een C-base, wordt het een U-base. Aangezien dit niet in het DNA voorkomt, wordt dit eruit geknipt door het enzym uracil DNA glycosylase. Als er bij een 5-methyl C atoom per ongeluk deaminatie plaats vindt, wordt dit een T-base. Dit wordt niet altijd gerepareerd en kan in de loop der tijd zijn gang gaan. Ongeveer 3/4e CG sequenties gaan verloren en daarom zijn er CG eilanden die zo een 1000-2000 nucleotides lang zijn. Deze zitten vaak bij 5’ eindes en geven zo de uiteindes van genen aan.

Wanneer een cel zijn functie toegewezen heeft gekregen, blijft de cel deze functie vaak ook houden. Vervolgens deelt deze cel en zal de cel dezelfde functie doorgeven aan dochtercellen. Dit is een vorm van cel geheugen en wordt epigenetische overerving genoemd. Dit is een brede term dat zorgt voor het fenotype van een cel of organisme, zonder dat de DNA sequentie veranderd of invloed uitoefent. Een voorbeeld hiervan is mono-allelische expressie waarbij een kopie van het gen gebruikt wordt. Een ander voorbeeld is genomische imprinting.

De sekse chromosomen zijn bij zoogdieren per mannetje en vrouwtje verschillend. Vrouwen, in de soort mensen, hebben een extra X-chromosoom ten opzichte van de mannen. Wanneer het ratio sekse chromosomen en autosome chromosomen niet klopt, zal het organisme niet overleven. Daarom is een doseringscompensatie mechanisme van belang. Een voorbeeld is de X-inactivatie bij vrouwen dat resulteert in het lichaam van Barr. X-inactivatie vindt plaats doordat één chromosoom een heterochromatine structuur heeft. Het niet actieve X-chromosoom wordt willekeurig bepaald (Xm voor mama of Xp voor papa). Deze blijft gedurende elke celcyclus inactief. Het X-chromosoom wordt inactief gesteld door het X-inactivatie centrum (XIC). Het middelstuk codeert voor XIST RNA dat het chromosoom omwikkeld en de structuur heterochromatine maakt. Sommige delen worden niet inactief gesteld, omdat de histonen daar ernstig zijn bewerkt en resistent zijn tegen XIST RNA. Fruitvliegjes hebben ook een doseringscompensatie mechanisme waarbij het mannetje zijn X-chromosoom twee keer zo hard laat werken. Dit gebeurt doordat de histonen replicatie een boost geven.

De sekse determinatie bij fruitvliegjes hangt af van drie RNA splicing momenten.

Post-transcriptionele controle mechanismen

Post-transcriptionele controle mechanismen vinden plaats na de RNA polymerase. Hierdoor worden de genen en eiwitten beschermd en gereguleerd. Transcriptie attenuatie is zo een mechanisme en zorgt ervoor dat de polymerase vroegtijdig stopt. HIV gaat het vroegtijdig beëindigen van de transcriptie tegen, waardoor het hele virale genoom gekopieerd kan worden. Dit proces komt ook voor in eukaryoten.

Een ander mechanisme, om gen expressie te reguleren, is het gebruik van riboschakelaars. Dit zijn korte RNA sequenties die binden aan kleine moleculen om hun conformatie te veranderen. Deze gaan vervolgens aan het 5’ einde zitten om de RNA polymerase te blokkeren.

Het volgende mechanisme is alternatieve RNA splicing en kan ervoor zorgen dat één stukje gen voor meerdere eiwitten kan coderen. Het RNA wordt op verschillende manieren geknipt waardoor er dus verschillende eiwitten ontstaan. Ook kunnen er andere eiwitten ontstaan doordat intronen niet goed uit het RNA worden geknipt. RNA splicing kan op twee manieren gebeuren: 1) negatief: door een regulerend molecuul wordt er een stukje overgeslagen en 2) positief: door een regulerend molecuul wordt er een stukje gen gekopieerd. Door het alternatief RNA knippen, moest de definitie van een gen aangepast worden.

De terminatie van RNA synthese resulteert uit een RNA knip reactie en de poly-A additie, zodat de C-terminaal verandert. Hierbij helpen de CstF concentratie, geproduceerd door B lymfocyten, om de knipplaats te veranderen.

RNA bewerking is het veranderen van de RNA nucleotide sequentie, waardoor ook de hele betekenis verandert. Dit gebeurt doordat een U-nucleotide wordt toegevoegd of verwijderd, waardoor het leeskader verandert. Gids RNa’s hebben een 5’ eind sequentie dat complementair is aan het einde van het gebied dat bewerkt moet worden. Bij zoogdieren worden A in I basen veranderd (de deaminatie van adenine) en C in A basen (de deaminatie van cytosine). De eerste verandering, A in I, komt veel voor bij mensen en ADAR’s zorgen voor deze reactie. De andere reactie komt ook veel voor in zoogdieren, bijvoorbeeld in de lever. Ook zorgt het ervoor dat de virale chromosomen dood gaan of inactief worden.

Een volgend post-transcriptioneel mechanisme is het gereguleerde kern transport. Dit wordt overgeslagen door het HIV virus. Het virale genoom is geïntegreerd in het genoom van de gastheercel. Deze kopieert het virale genoom vaak, maar bevat vele intronen en blokkeert hierdoor de transportatie van het gen. Het HIV genoom produceert een eiwit (Rev) dat zich bindt aan RRE op een intron. Dit reageert met exportin1 en wordt toch de celkern uit getransporteerd.

Er zijn gebieden in het cytoplasma waar mRNA’s heen worden getransporteerd (door het cytoskelet) of ze zweven er door middel van diffusie naar toe. Vervolgens worden ze in bepaalde gebieden gebruikt of afgebroken. Hiervoor hebben ze gebieden nodig die signalen afgeven. Een voorbeeld van zo een gebied is het UTR (3’ untranslated region). Dit gebied verlengt het stopcodon en beëindigt de synthese en start de aanmaak van de poly-A staart. De UTR is een gebied dat niet codeert voor een eiwit, maar wel wat er met het RNA moet gebeuren. De eiwitten die weten wat er met de sequenties moet gebeuren, binden aan het RNA. De 3’ en 5’ UTR gebieden van het mRNA molecuul, regelen de translatie. Bacteriële mRNA’s bevatten de Shine-Dalgarno sequenties en zorgt ervoor dat de AUG sequentie goed in het ribosoom komt te zitten. Bij eukaryoten is dat de 5’ kap. Dit zijn twee vormen van translationele controle.

Wanneer een cel de mogelijkheid niet heeft om translatie te beginnen, door ziekte of ondervoeding, zal dit ook niet gebeuren. De fosforlisatie zorgt ervoor dat de translatie in zijn algemeenheid niet begint.

Bij de AUG codons, richting de translatie start, kan de eukaryotische translatie beginnen. Er kunnen enkele AUG codons overgeslagen worden (‘leaky scanning’). Een andere manier dat translatie kan beginnen, onafhankelijk van de AUG sequentie, is het gebruik maken van een interne ribosoom entree plaats. Dit zijn sequenties op het mRNA die zelf ook translatie kunnen beginnen.

De gen expressie kan ook gereguleerd worden door de stabiliteit. Wanneer de 3’ poly-A staart of de 5’ kap kapot gaan, zullen de sequenties snel afbreken. In het cytosol wordt de poly-A staart soms verlengd, zodat er een extra vorm is van translatie regulatie. Kleine niet coderende RNA transcripten (microRNA) reguleren vele dierlijke en planten genen. Deze sequenties coderen niet voor eiwitten, maar reguleren juist de coderende genen. Ook dit RNA wordt gemaakt door polymerase 2 en krijgt een 5’ eind kap en een 3’ poly-A staart. Vervolgens bindt dit met een RISC eiwit (RNA-induced silencing complex) om bepaalde mRNA’s af te breken of stil te leggen. De translatie kan onderdrukt worden en het mRNA ontwricht, zodat de poly-A staart korter wordt en het mRNA naar delen in het cytosol gaat om afgebroken te worden. Dit worden proces lichamen genoemd (P-bodies). miRNA’s zijn goede regulatoren, want ze hebben een grote impact, kunnen combinaties maken met elkaar en andere eiwitten en ze nemen weinig ruimte in op het genoom.

RNA interferentie (RNAi) wordt gebruikt om de cel te beschermen. Het zorgt ervoor dat dubbel strengse genomen van virussen verwijdert worden. RNAi wordt geknipt door Dicer in kleine stukjes waardoor small interfering RNA (siRNA) moleculen ontstaan. Deze zijn enkel strengs en binden aan het virale genoom om deze af te breken of weg te knippen met behulp van endonuclease.

RNAi kan ook zorgen voor de formatie van heterochromatine structuren. Dit gebeurt achter polymerase 2 en stopt de transcriptie.

RNAi is belangrijk voor onderzoek en medische ingrepen, omdat op deze manier genen uitgezet kunnen worden die niet goed werken.

15. Cel communicatie

Communicatie tussen cellen wordt geregeld door extracellulaire signaal moleculen. Het ontvangen van signalen hangt af van receptor eiwitten die meestal op het oppervlakte van een cel zitten. De receptor wordt geactiveerd waardoor het intracellulaire signaleringspad geactiveerd wordt. Deze paden bestaan uit intracellulaire signaleringseiwitten en zorgen dat het juiste doel behaald wordt (target eiwitten).

Algemene principes van cel communicatie

De principes van communicatie zijn deels gevonden in bacteriën (opnemen van producten uit de omgeving voor antibiotica productie, sporen informatie en seksuele conjugatie) en gist cellen (paren). Daarnaast hebben de fruitvliegjes goed geholpen om cel communicatie te begrijpen.

Vele signaal moleculen worden gebruikt om te communiceren. Voorbeelden zijn nucleotides, steroïdes en zelfs gassen. Deze worden uitgescheiden door de cel en op het oppervlakte geplaatst of naar verre doelen gestuurd. De signalen worden ontvangen door receptoren. Een voorbeeld van een extracellulair signaal molecuul is de ligand. Sommigen zijn contact-afhankelijke signaleringen, maar de meeste scheiden stoffen uit in de extracellulaire vloeistof. Dit kan lokaal gebeuren (lokale mediatoren), maar ook verder weg. Dit zijn vormen van paracrine signalering (andere cellen beïnvloeden), maar dit kan ook autocrine signalering zijn (cellen signaleren naar zichzelf). Heparan sulfaat proteoglycans immobiliseert de paracrine eiwitten en antagonisten blokkeren ze.

Een andere vorm van signalering is de synaptische signalering, een actie potentiaal, door neuronen. Zij geven neurotransmitters af aan het eind van hun axon om ‘informatie’ door te geven. Ook worden lange afstandssignalen afgegeven door endocriene cellen die gebruik maken van hormonen. De synaptische signalering is preciezer dan de signalen van endocriene cellen. De snelheid van een signaal ligt niet alleen aan de snelheid van de vurende cellen, maar ook aan de tijd dat een respons nodig heeft.

Soms worden er ook signalen gedeeld door cellen door middel van kloof verbindingen (gap junctions). Dit zijn een soort tunnels tussen twee cellen die kleine niet organische moleculen door laten. Door middel van diffusie wordt het signaal ‘verdeeld’ en ontstaat er dezelfde conditie in beide cellen. Kloof verbindingen helpen cellen die niet direct aan de signalerende cel liggen om toch het signaal te ontvangen.

Er zijn vele soorten en combinaties van signalen, dus elke cel is geprogrammeerd om te reageren op de juiste combinaties van extracellulaire signaal moleculen. Celdood is ook geprogrammeerd, maar vindt vaak plaats als er iets niet is voor de cel.

Er zijn verschillende cellen die anders kunnen reageren op dezelfde extracellulaire signaal moleculen. Het ligt aan de intracellulaire condities hoe het signaal geïnterpreteerd wordt. Nu zullen er verschillen tussen cellen besproken worden.

Een morfogen is een signaal molecuul dat een patroon kan uitstrijken over een groep cellen en vervolgens het lot bepalen van die cellen. Dit kunnen verschillende patronen zijn in verschillende gebieden waardoor er andere cellen ontstaan. Hun lot hangt dus af van hun positie in bepaalde morfogen gradiënten.

Wanneer het signaal binnen in de cel is geweest, komen de oude concentraties weer terug. Een binnenkomend molecuul heeft een bepaalde duur nodig om van zijn oude naar zijn nieuwe evenwicht te gaan. De duur heet de ‘half-life’ en is de tijd dat nodig is voor de halvering van de concentratie, als alle synthese is gestopt. Een cel kan dus de concentratie van het intracellulaire molecuul veranderen, als de levensduur van dat molecuul kort is.

Er zijn moleculen die de intracellulaire receptoren activeren. Deze moleculen zijn stikstofmonoxide (NO) en steroïde hormonen. Sommige signalen zijn hydrofoob en klein om door het plasma membraan te verdwijnen. Autonome zenuwen ontladen acetylcholine dat vervolgens reageert op de endotheelcellen van de bloedwand. Deze reageren door het ontladen van NO, zodat de bloedwand breder wordt. NO wordt gemaakt door de de-aminatie van arginine, gekatalyseerd door het enzym NO synthase (NOS). Het heeft een ‘half-life’ van 5-10 seconden waarna het wordt omgezet naar nitraten en nitrieten door water en zuurstof. NO verhoogt ook de concentratie van cyclisch GMP door aan de actieve bindingsplaats van het enzym guanylyl cyclase te binden. Koolstofmonoxide (CO) is een ander gas, net zoals NO, maar er zijn er meer.

Er zijn signaal moleculen die direct door het plasma gaan (hydrofoob) en binden aan intracellulaire receptoren om de transcriptie te reguleren. De receptoren horen tot een grote kern receptor familie, omdat ze op elkaar lijken. De signaal moleculen zijn steroïde hormonen en cortisol, thyroïde hormonen, retinoïdes en vitamine D vallen onder deze naam. Cortisol bindt pas aan het DNA als het een ligand bevat. De thyroïde en de retinoïde hormonen binden zonder ligand aan het DNA. Thyroïde hormonen remmen transcriptie als er een ligand aan het hormoon bindt. Vaak zorgt de ligand voor activatie van het hormoon, transcriptie of remt het juist de transcriptie.

Een kern receptor eiwit dat aan het oppervlakte gaat zitten en extracellulaire signalen omzet in intracellulaire signalen, worden signaal omzetters genoemd. Er zijn drie belangrijke omzetters:

·         Ion-kanaal-gekoppelde receptor: wordt gebruikt bij elektrisch geladen signalen, zoals bij spieren of zenuwen. Het maakt gebruik van neurotransmitters om de kanalen open te zetten.

·         G-eiwit-gekoppelde receptor: een eiwit dat zich koppelt aan een eiwit zodat de concentratie in de cel verandert. Zo een eiwit zijn de enzym- of ion kanalen.

·         Enzym-gekoppelde receptoren werken direct als enzym of werken samen met andere enzymen. Vaak hebben ze hun ligand binding buiten de cel en hun enzymbindingsplaats aan de binnenkant voor de katalytische reactie.

De meeste oppervlakte receptoren zenden opnieuw signalen uit door middel van kleine moleculen en intracellulaire signaleringseiwitten. De receptoren, G-eiwit of enzym, krijgen het eerste signaal en de kleine intracellulaire mediatoren, tweede boodschappers, krijgen het tweede signaal. De grote intracellulaire signaleringseiwitten vormen een netwerk en kunnen signalen op de volgende manieren doorgeven:

·         Het eiwit kan het signaal opnieuw uitzenden naar het volgende onderdeel in de ketting.

·         Het eiwit kan ervoor zorgen dat twee of meerdere signaleringseiwitten bij elkaar komen zodat ze samen sneller en efficiënter kunnen communiceren.

·         Het eiwit kan het signaal veranderen, zodat het signaal goed is om het signaal door te geven of om een cel respons te stimuleren.

·         Het eiwit kan het signaal versterken door veel intracellulaire mediatoren te maken of kopieën van andere eiwitten te activeren. Versterking van het signaal wordt ook wel signaleringscascade genoemd.

·         Het eiwit krijgt soms meerdere signalen binnen en vat deze samen, voordat het signaal wordt doorgegeven.

·         Het eiwit kan het signaal verspreiden richting meerdere paden.

·         Het eiwit kan een signaleringseiwit vastleggen in een pad waar het nodig is.

·         Het eiwit kan de activiteit en daarbij de sterkte van een signaal reguleren.

Vele intracellulaire signaleringseiwitten dienen als moleculaire schakelaars die signalen aan- of uitzetten. Deze eiwitten worden geactiveerd door fosforylatie of door een GTP binding. De fosforylatie (in)activeert een signaal door het toevoegen of het verwijderen van een fosfaatgroep. Een eiwit kinase voegt een fosfaatgroep toe en een eiwit fosfatase verwijdert een fosfaatgroep. De eiwitkinases zijn georganiseerd in een ketting waarbij telkens het volgende molecuul geactiveerd wordt (fosforylatie cascade). Twee grote typen kinases zijn de serine/threonine kinases (fosforlyseren eiwitten op serines en soms threonines) en de tyrosine kinases (fosforlyseert de eiwitten op tyrosines).

De GTP-bindingseiwitten zijn actief als GTP is gebonden en inactief als GDP is gebonden. Er zijn twee klassen: 1) grote trimerische GTP-bindingseiwitten, G eiwitten, die het signaal van G receptoren opnieuw uitzenden en 2) monomerische GTPases zenden signalen van verschillende oppervlakte receptoren opnieuw uit. Beide GTP-bindingseiwitten worden gereguleerd door GTPase-activerende eiwitten. Deze inactiveren de eiwitten door hydrolyse van GTP. De G-eiwit-gekoppende receptoren activeren trimerische eiwitten en guanine nucleotide exchange factor (GEF) activeren monomerische eiwitten; door middel van de promotie van GTP in plaats van GDP.

Een strategie om signalen te laten reageren met de juiste receptoren, worden er intracellulaire signaleringscomplexen gevormd door stellage eiwitten. Hierdoor worden de snelheid, efficiëntie en precisie van de respons verbeterd. De interactie tussen de intracellulaire signaleringseiwitten worden geregeld door interactie domeinen. Deze domeinen bevinden zich in de eiwitten. Voorbeelden hiervan zijn SH2 en PTB binden aan gefosforliseerde tyrosines aan geactiveerde receptoren, SH3 bindt aan proline-rijke aminozuur sequenties en PH bindt aan specifieke fosfo-inositides door een extracellulair signaal. Sommige domeinen functioneren als adaptoren om twee eiwitten aan elkaar te binden in een signaleringspad.

Een andere manier om receptoren en intracellulaire signaleringseiwitten samen te brengen, is om ze te concentreren in een gebied in de cel. Een voorbeeld is het primaire cilium.

De concentratie in een cel kan geleidelijk of abrupt veranderen en de cel heeft verschillende mechanismen voor het extracellulaire signaal. De snelheid van een geleidelijke concentratieverandering ligt aan de hoeveelheid samenwerkende moleculen en fosfaten. Om alles-of-niets responses te creëren, wordt er gebruik gemaakt van positieve en negatieve feedback loops. Positieve feedback loops kunnen het signaal versterken, maar als er een bepaald niveau bereikt wordt, kan er veel meer bereikt worden. De behaalde concentratie heeft vaak geen extra signalen nodig om op dat level te blijven. Het wordt een soort schakelaar en kan de functie aan of uitzetten.

De negatieve feedback kan resulteren in drie soorten signalen: 1) een binnenkomend signaal wordt geremd, 2) een signaal heeft een hoger transitielevel nodig om zijn functie uit te voeren en heeft een korte vertraging en 3) heeft een lang durende vertraging en zorgt voor oscillaties. Wanneer een signaal wordt gegeven, is er soms een tweede, sterker signaal nodig om een volgende reactie te geven. Dit wordt adaptatie (gewenning) of ongevoeligheid genoemd. Hierbij worden receptoren ongevoelig, maar er kunnen ook andere oorzaken zijn.

Signalering door G-eiwit-gekoppelde-celoppervlakte receptoren en kleine intracellulaire mediatoren

G-eiwit-gekoppelde-celoppervlakte receptoren (GPCR’en) worden gebruikt door elk eukaryotisch organisme. Ze reageren op hormonen, neurotransmitters, lokale mediatoren, geur, zicht en smaak. Ondanks alle diverse bindingen die ze maken, lijken ze wel op elkaar. Elke receptor bevat een polypeptide ketting dat opgevouwen in het membraan zit. Zeven keer loopt de streng door het membraan. De trimerische G eiwitten (G eiwit) zenden signalen van GPCR’en opnieuw uit. Dit gebeurt doordat de receptor van vorm veranderd, omdat een extracellulair signaal molecuul bindt aan de GPCR. Het G eiwit bestaat uit drie eiwit subunits: alpha, beta en gamma. Het eiwit is inactief als er een GDP gebonden is aan alpha. Het eiwit laat alpha zijn GDP afstaan voor GTP om actief te worden. De G eiwit signaleringsregulatoren (RGS) bindt aan het alpha subunit, om de G-eiwit medieer responses bij eukaryoten inactief te stellen.

Sommige G eiwitten reguleren de productie van cyclisch AMP. cAMP gedraagt zich als een kleine intracellulaire mediator en zijn concentratie kan in een aantal seconden twintig keer zoveel worden. Het wordt gemaakt door adenylyl cyclase en het wordt afgebroken door cyclisch AMP fosfordi-esterase. GPCR’en die de cAMP concentratie verhogen, zijn gekoppeld aan stimulerende G eiwitten (Gs). Inhiberende G eiwitten (gi) inhiberen adenylyl cyclase, maar werkt ook direct op ionkanalen. Cholera wordt veroorzaakt door foute bindingen aan Gs.

Cyclisch AMP activeert cyclisch AMP-afhankelijk eiwit kinase (PKA). Deze kinase fosforliseert serines of threonines aan geselecteerde eiwitten, zoals intracellulaire signaleringseiwitten of effector eiwitten. PKA reguleert verschillende celtypen waardoor de effecten ervan verschillen. Inactief PKA bestaat uit twee regulerende en twee inactieve katalytische subunits. De katalytische subunits worden losgelaten als cyclisch AMP bindt aan het complex. Wanneer cellen gestimuleerd moeten worden, wordt de cAMP concentratie veel hoger zodat er veel actief PKA ontstaat. Dit is een korte impuls, omdat fosfordi-esterase de cAMP concentratie snel weer verlaagt.

Een cAMP respons element (CRE) is een DNA sequentie en wordt herkend door het CRE-bindingseiwit (CREB). Dit is een gen regulerend eiwit dat gefosforliseerd wordt als cAMP actief is, zodat CREB een transcriptionele coactivator, CBP, oproept. Hierdoor worden bepaalde sequenties gekopieerd.

GPCR’en activeren het membraan gebonden enzym fosforlipase C-beta (PLCbeta) door middel van G eiwitten. De PLCbeta activeert het fosfatidylinositol 4,5-bifosfaat (PIP2). Receptoren die actief worden door een inositol fosforlipide signaleringspad, worden dit vanwege een G eiwit: Gq. Vervolgens maakt PIP2 twee producten: 1) inositol 1,4,5-trifosfaat (IP3) en 2) diacylglycerol. Inositol 1,4,5-trifosfaat diffuseert in het cytosol waarna het bij het ER komt. Het bindt en opent de IP3 receptoren (IP3-poort Ca²⁺-vrijlatingsreceptoren). Ca²⁺ komt vrij in het cytosol. Vervolgens veranderen de IP3 moleculen in IP2 of IP4 en het Ca²⁺ verlaat de cel. Diaglycerol, het tweede bijproduct door het knippen van PIP2, komt in de cel terwijl Ca²⁺ toeneemt. Het kan kleine lipide signaalmoleculen maken, zich gedragen als moleculaire mediator of het activeert eiwit kinase C (PKC) dat afhankelijk is van Ca²⁺. PKC wordt actief op het membraan aan de binnenkant door Ca²⁺, diacylglycerol en het negatief geladen membraan. Dit zijn conventionele PKC’s, als ze niet zo actief worden, dan heten het atypische PKC’s. Vervolgens forforliseert PKC bepaalde eiwitten, afhankelijk van het celtype.

Ca²⁺ activeert receptoren in de cel, maar ook buiten de cel door middel van een ligand waardoor Ca²⁺ binnen gelaten wordt. Ca²⁺ uit het ER activeert IP3 receptoren en ryanodine receptoren (versterken het Ca²⁺ signaal). Daarnaast bevat een cel Na⁺/ Ca²⁺ pompen om Ca²⁺ uit het cytosol te pompen.

Ca²⁺ neemt snel toe en af in bepaalde gebieden, waardoor er oscillatie’s ontstaan. Dit komt door een vertraagd feedback signaal uit de IP3 en ryanodine receptoren. Vervolgens bepaalt het aantal frequenties van de oscillatie’s de respons van de cel. Calmodulin regelt vele Ca²⁺ processen. Ca²⁺ bindt aan de calmodulin, minstens twee en maximaal vier, om de calmodulin te activeren (conformatie verandering). Het Ca²⁺/calmodulin complex bindt aan bepaalde enzymen en membranen, om deze te reguleren. Het Ca²⁺/calmodulin-afhankelijk kinase (CaM-kinase) reguleert de transcriptie van bepaalde genen, doordat ze gen regulerende eiwitten fosforliseren. CaM-kinase 2 komt veel voor in het zenuwstelsel en in synapsen. Het kan een functie hebben als een moleculair geheugen apparaat. Het wordt geactiveerd door Ca²⁺/calmodulin complex en blijft actief door autofosforlisatie. Daarnaast wordt het ‘geheugen’ van CaM-kinase 2 gebruikt om de Ca²⁺ oscillatie frequenties te decoderen.

Sommige G eiwitten reguleren direct ionkanalen door de lading te veranderen. Smaak en visie worden bepaald door cyclisch nucleotide poort ionkanalen, gereguleerd door GPCR. Olfactorische receptoren bevatten cilia die de geuren ontvangen. Vervolgens wordt er Golf geactiveerd die de adenylyl cyclase activeert. Daarna vindt er een influx van Na+ in de cel plaats door cyclisch AMP poort cation kanalen. Feromonen, sekshormonen, zijn speciale geuren tussen soorten, maar bij de mens ontbreken deze geuren.

Visie wordt gereguleerd door cyclisch GMP. De staafjes verzorgen zicht in dimlicht en kegeltjes de kleuren in fel licht. Het staafje geeft een signaal door aan een retinale zenuwcel, waar het heruitgezonden wordt richting het brein. Het buiten segment van het staafje bevat allemaal schijven met rhodopsin moleculen. Het plasma membraan rondom het buiten segment bevat cyclisch GMP poort cation kanalen. Wanneer er fel licht is, hyperpolariseren deze kanalen zodat ze geïnhibeerd worden. Een foton zorgt voor een conformationele verandering (actief) in rhodopsin, waardoor transcucin (Gt) ook van vorm verandert. Vervolgens activeert het alpha subunit de cyclisch GMP fosfordi-esterase, waardoor de hoeveelheid GMP afneemt en er een elektrisch signaal wordt afgegeven. Rhodopsin kinase en arrestin inhiberen de rhodopsin activiteit. Als de Ca2+ concentratie daalt, zal de cyclisch GMP zijn normale concentratie weer aannemen. Hierbij versterken intracellulaire mediatoren en enzymatische cascades de extracellulaire signalen. Er vindt een toename plaats van vele moleculen en concentraties.

Een cel kan gewend raken aan een langdurend signaal en daardoor minder of geen activiteit meer vertonen. Een GPCR’en worden op drie manieren ongevoelig gemaakt voor signalen door één van de leden uit de GPCR kinase familie (GRK):

1.     Receptor inactivatie door een verandering zodat ze niet kunnen communiceren met G eiwitten.

2.     Receptor beslaglegging door het naar binnen halen van de receptor zodat ze niet kunnen communiceren met hun ligand.

3.     Receptor down-regulatie is het afbreken van receptoren door lysozomen.

Als een receptor gefosforliseerd is door een GRK, bindt het aan een arrestin. Dit helpt de ongevoeligheid van receptoren verder.

Signalering door enzym gekoppelde celoppervlakte receptoren

Enzym gekoppelde receptoren zitten enkelstrengs door het membraan heen met hun ligand bindingsdomein aan de buitenkant. Deze receptoren hebben directe enzymatische activiteiten of activeren andere enzymen. Er zijn zes klassen van enzym gekoppelde receptoren:

1.      Receptor tyrosine kinases fosforliseren tyrosines aan zichzelf en aan intracellulaire signaleringseiwitten.

2.      Tyrosine kinase associatie receptoren hebben geen enzym activiteit, maar gebruiken cytoplasmatische tyrosine kinase om het signaal opnieuw door te versturen.

3.      Receptor serine/threonine kinase fosforliseren serine of threonine op zichzelf en op gen regulerende eiwitten waarmee ze samenwerken.

4.      Histidine kinase associatie receptoren fosforliseren zichzelf op een histidine, waarna de fosforgroep direct richting een tweede intracellulair signaleringseiwit wordt gebracht.

5.      Receptor guanylyl cyclase katalyseert de productie van cyclisch GMP in het cytosol, dat als een klein intracellulaire mediator werkt.

6.      Receptor’like’ tyrosine fosfatase dat de fosfaatgroepen van tyrosines of intracellulaire signaleringseiwitten verwijdert.

Vele extracellulaire signaleringseiwitten en celoppervlakte gebonden extracellulaire signaleringseiwitten gebruiken receptor tyrosine kinases (RTK). Ephrins zijn de grootste groep ligand moleculen voor deze groep en hebben speciale Eph receptoren. Dit zijn speciale ligand moleculen en receptoren, omdat ze bidirectioneel kunnen signaleren: de receptor wordt actief door de ligand en de ligand zelf ook. Als de receptor actief wordt, fosforliseert de tyrosines aan zichzelf en aan intracellulaire signaleringseiwitten. Dit doen ze door twee receptorkettingen samen te brengen, zodat de kinasedomeinen dicht bij elkaar komen om actief te worden en transautofosforlisatie uit kunnen voeren.

De fosforlisatie van tyrosines zorgt voor een verhoogde activiteit van de kinase activiteit van het enzym en het zorgt dat er een verhoogde affiniteit ontstaat voor intracellulaire signalen op bindingsplaatsen. Er zit een extra receptor (‘docking site’; IRS1), dat geactiveerd wordt door fosforlisatie door het kinase domein. Vervolgens kunnen er veel meer bindingen gemaakt worden op de receptor. Fosforlipase C-y (functioneert hetzelfde als fosforlipase C-ß), Src (fosforliseert andere signaal eiwitten op tyrosines) en PI 3-kinase (fosforliseert lipides) binden aan gefosforliseerde tyrosines. Ze binden aan de gefosforliseerde tyrosine door middel van hun SH2 domein of PTB domein.

De Ras superfamilie bevat monomerische GTPases en samen met de Rho familie zijn zij de enige die signalen opnieuw uitzenden van cel oppervlakte receptoren. Ras bevat een covalent gebonden lipide groep zodat hij vast kan zitten aan de binnenkant van het membraan. Ras zorgt ook voor de snelle toename en determinatie in cellen, wat soms kanker kan veroorzaken. Ook Ras is een moleculaire schakelaar; GTP gebonden is actief en GDP gebonden is inactief door conformationele veranderingen. Ras-GEF stimuleert de dissociatie van GDP en daarmee de activatie. Ras-GAP stimuleert de hydrolyse van gebonden GTP en daarmee de inactivatie. De Ras eiwitten zijn goed behouden gebleven in organismen zoals bij de Drosophila en de C. elegans. Uit studies met deze organismen, en andere studies, is gebleken dat het koppelen van RTK’s aan Ras hetzelfde gebeurt bij zoogdieren. Het adapter eiwit dat hiervoor zorgt, is Grb2. Sos is een gen dat codeert een Ras-GEF, nodig voor een RTK, dat Ras activeert.

Ras activeert vele signaleringseiwitten, zodat het signaal doorgegeven wordt. Om cellen te laten groeien en te differentiëren, moet er langer een signaal afgegeven worden dat de kern bereikt om gen expressie te veranderen. Dit wordt gedaan door mitogen-geactiveerd eiwit kinase module (MAP kinase module). Het bestaat uit drie componenten die een Ras-MAP-kinase signaleringspad vormen. De drie componenten zijn MAPKinase (Erk bij zoogdieren), MAPKK (Mek; voor fosforlatie en activatie van MAP kinase) en MAPKKK (Raf; en activeert fosforliseert MAPKK). Het geactiveerde MAPK fosforliseert eiwitten en gen regulerende eiwitten om het signaal door te geven. Deze signalen kunnen dus lang aanhouden, omdat genen geactiveerd worden die coderen voor celdeling, fosfatase genen en het stabiliseren van het enzym tegen afbraak.

Het pad dat hierboven is beschreven, activeert veel soorten eiwitten en genen, maar die communicatie moet niet in de war raken. Er zijn montage eiwitten die ervoor zorgen dat de kinases samenbinden om een complex te vormen, zodat ze specifieker signalen kunnen afgeven.

De Rho familie bestaat uit monomerisch GTPases en reguleren het cytoskelet voor vorm, beweeglijkheid en adhesie, maar ook reguleren ze de cel cyclus, gen transcriptie en membraan transport. Verder reguleren ze de cel migratie en de axon groei. Er zijn drie belangrijke leden uit de familie: Rho, Rac en Cdc42. Inactieve Rho’s bevinden zich in het cytoplasma gebonden aan guanine nucleotide dissociatie remmers (GDI), omdat ze anders actief gesteld worden door actieve Rho-GEF moleculen op het membraan. Een andere manier om ze actief te stellen, is door middel van een Eph RTK op motor neuronen om de axon richting de spier te brengen. Ephrin bindt aan de receptor en om ze in goede banen te leiden, wordt een Rho-GEF (ephexin) gebruikt. Ephexin activeert het RhoA eiwit en reguleert aankomende eiwitten. Ephrins zijn goede leidende eiwitten.

RTK’s gebruiken GEF’s en GTPases om signalen door te geven, maar ook fosforinositide 3-kinase (PI 3-kinase). Het fosforliseert lipides in plaats van eiwitten en zorgt voor het groeien en het overleven van de cel. Fosfatidylinositol (PI) kan omkeerbare fosforlisaties op meerdere plaatsen ontvangen om fosforinositides te vormen. PI(3,4,5)P3 is belangrijk voor het vormen van signaleringscomplexen. RTK’s activeren klasse 1 PI 3-kinases, waar een adapter twee fosfortyrosines bindt op actief RTK door de twee SH2 domeinen. GPCR’en activeren klasse 2 PI 3-kinases, waar een regulerend subunit bindt aan een ßy complex van een actief G eiwit. Intracellulaire signaleringseiwitten binden aan PI(3,4,5)P3 met behulp van een speciaal pleckstrin homoloog (PH) domein.

Akt en PDK1 worden door PIP3 verzameld en bevatten een PH-domein. Beiden zorgen ze voor de overleving en groei van cellen. Dit doet Akt door het eiwit Bad te fosforliseren, omdat Bad anders voor celdood zorgt. Het PI-3-kinase-Akt-pad geeft signalen aan cellen om te groeien op basis van een serine/threonine eiwit kinase TOR (mTOR bij zoogdieren). Het bestaat uit twee complexen:

·         mTOR complex 1 bevat het eiwit raptor dat gevoelig is voor rapamycine en stimuleert celgroei door ribosoom productie en eiwit synthese te promoten. Rheb, een GTPase, activeert ook mTOR.

·         mTOR complex 2 bevat het eiwit rictor en is niet gevoelig voor rapamycin, activeert Akt en reguleert het cytoskelet met behulp van Rho.

RTK’s en GPCR’en activeren paden die elkaar overlappen.

De tyrosine-kinase-associatie receptoren hebben cytoplasmische tyrosine kinases nodig. De genoemde receptoren gebruiken tyrosine, maar hebben hier geen domein voor en gebruiken dus extra receptoren van andere eiwitten. Een voorbeeld van cytoplasmische tyrosine kinases is de Src familie dat SH2 en SH3 domeinen bevat. Er zijn cytoplasmische tyrosine kinases die werken met integrins. Deze clusteren samen op matrix plaatsen en vormen de samenstelling van cel-matrix samenvoegingen (focal adhesies). Hierbij wordt focal adhesie kinase (FAK) gebruikt om elkaar onderling te fosforliseren, waardoor de Src kinase kan binden. Deze fosforliseren elkaar vervolgens om signalen af te geven voor celgroei.

Cytokine receptoren gebruiken een cytoplasmisch tyrosine kinase, Janus kinase (JAK) om signalen door te geven. Het zijn receptoren die voor vele hormonen of mediatoren een thuisbasis is. JAK activeert, en fosforliseert dus, gen regulerende eiwitten genaamd STAT (signal transducers and activators of transcription). Het JAK-STAT signaleringspad gaat direct naar de celkern om transcriptie te reguleren. Twee JAK’s komen samen en fosforliseren elkaar om de activiteit van tyrosine kinase domeinen te verhogen. Vervolgens fosforliseren JAK’s tyrosines op de cytokine receptoren zodat STAT’s kunnen binden. Het SH2 domein fosforliseert STAT op tyrosines en vervolgens binden de STAT’s aan elkaar om een dimeer of heteromeer te vormen. Vervolgens gaat de STAT de celkern in. Om dit pad te remmen, moet er defosforlisatie plaats vinden. Dit gebeurt door tyrosine fosforlisaties te bewerken met eiwit tyrosine fosfatase.

Er zijn ook enzym gekoppelde receptoren die volledig afhangen van serine-threonine kinases. Deze fosforliseren gen regulerende eiwitten, Smads, die in de celkern worden getransporteerd. De transformerende groei factor-ß (TGFß) superfamilie maakt gebruik van de serine/threonine kinases en Smads. Het bevat de TGFß/activin familie en de bot morfogenetisch eiwit (BMP) familie. Er zijn twee typen serine/threonine kinases die bij elkaar komen en elkaar kunnen fosforliseren. De actieve type 1 receptor bindt, fosforliseert een Smad en wordt de cel in gestuurd. Ook dit pad wordt gereguleerd door negatieve feedback.

Al deze signalen, kinases en onderdelen zijn een zeer structureel geregeld complex, wat moeilijk te begrijpen is als een geheel.

Bacteriële chemotaxis is een beweging waarbij een bacterie wegdrijft van een bepaalde chemische omgeving. De chemotaxis beweging wordt geregeld door histidine-kinase-associatie receptoren. Deze receptoren activeren een pad dat bestaat uit twee delen. Het zwemmen van een bacterie wordt gedaan door de flagella (slierten achter de bacterie). Wanneer een bacterie een richting op moet, zal deze in een rechte lijn zwemmen. Anders draait de bacterie maar chaotisch rondjes. De respons, richting of weg van een chemische substantie zwemmen, wordt bepaald door de chemotaxis receptoren.

Een bacterie past zich aan, aan de omgeving of is ongevoelig voor de omgeving door middel van methylatie. Als een ligand bindt aan de receptor, zorgt het voor een verminderde activiteit van CheA, voor minder tollen, en het methyleert de receptor zodat het CheA weer zijn normale activiteit kan geven.

Signaleringspaden die afhankelijk zijn van gereguleerde proteolyse van latente gen regulerende eiwitten

Er zijn signaleringspaden die afhangen van gereguleerde proteolyse. Dit fenomeen controleert de activiteit en locaties van latente gen regulerende eiwitten. Deze dringen de celkern binnen en reguleren transcriptie pas als ze een seintje hebben gekregen. Smad en STAT’s doen dit ook pas na een signaal, maar fosforliseren en breken eiwitten niet af. Er zullen vier paden besproken worden die betrokken zijn bij cellen die telkens opnieuw geproduceerd moeten worden: Notch, Wnt, Hedgehog eiwitten en NFkB.

Het Notch receptor eiwit werkt in Drosophila voor de productie van zenuwstelsel, maar ook voor de continue aanmaak van de maag. Als een cel een zenuwcel wordt, dan geeft het een signaal af dat ervoor zorgt dat andere cellen dit niet ook doen (laterale inhibitie). Dit wordt geregeld door een signaal mechanisme: Delta. Op de Notch receptor zit Delta dat zich bindt aan de buren. De Notch receptor laat dan een staart los in de cel dat richting de celkern zwemt om bepaalde genen te activeren.

Wnt eiwitten zijn uitgescheiden signaalmoleculen die werken als lokale mediatoren. Ze kunnen drie intracellulaire signaleringspaden activeren: 1) Wnt/ß-catenine pad, 2) het planaire polariteitspad en 3) Wnt/Ca²⁺ pad. Alle drie de paden beginnen met het binden van Wnt’s aan Frizzled familie celoppervlakte receptoren. Vervolgens wordt het Dishevelled eiwit opgeroepen om de signalen door te geven. Het Wnt/ß-catenine pad reguleert proteolyse van ß-catenine (cel-celadhesie en gen regulatie). Wnt bindt aan Frizzled en aan een co-receptor eiwit, een soort lage dichtheid lipo-eiwit, en wordt daarom een LDL-receptor gerelateerd eiwit genoemd. De degradatie van cytoplasmisch ß-catenine wordt geregeld door een degradatie complex. Dit complex bestaat uit vier eiwitten: 1) caseine kinase 1 voor fosforlisatie van ß-catenine zodat het ver weg gefosforliseerd kan worden door 2) glycogeen synthase kinase 3 (GSK3) en labelt het voor ubiquitilatie, en 3) axin en 4) APC houden het complex bij elkaar. Dit complex wordt afgebroken als ß-catenine nodig is voor genregulatie.

Net zoals Wnt eiwitten, zijn Hedgehog eiwitten signaleringsmoleculen die werken als lokale mediatoren en morfogenen in weefsel. Één Hedgehog eiwit is gevonden in de Drosophila en geeft de mutant stekeltjes, als een egel. De actieve vormen van Hedgehog eiwitten bij gewervelden hebben te maken met cholesterol en zitten aan vetzuurkettingen vast. Drie transmembranen mediëren de respons van Hedgehog eiwitten:

·         Patched zit twaalf keer door het membraan heen en het bindt aan het Hedgehog eiwit.

·         iHog eiwitten hebben vier of vijf immunoglobine domeinen en twee of drie fibronectintype-3 domeinen. Ze functioneren als co-receptoren voor Hedgehog eiwitten, net zoals Patched.

·         Smoothend wordt actief als Patched en iHog actief worden, waardoor Patched afgebroken wordt. Hierdoor wordt er een signaal doorgegeven.

Het signaal wordt opgevangen door Cubitus interruptus (Ci). Als er geen signaal is, wordt dit afgebroken. De Ci wordt gevormd tot een kleiner eiwit in de celkern om Hedgehog genen stil te houden. Eenmaal in de cel aangekomen, worden de genen geactiveerd waaronder Patched, dat negatieve feedback doorgeeft.

NFkB eiwitten zijn latente gen regulerende eiwitten die van belang zijn tijdens stressvolle situaties, ontstekingen en aangeboren immuun responsen. Deze eiwitten worden inactief gehouden door IkB eiwitten. Als ze actief moeten worden, worden de IkB eiwitten gefosforliseert, ge-ubiquitylatieerd en gedegradeerd.

Signalering bij planten

Multicellulariteit en cel communicatie zijn onafhankelijk van elkaar geëvolueerd bij planten en dieren. In tegenstelling tot de grote hoeveelheid GPCR’en in dieren, hebben planten de receptor serine/threonine kinases als de grootste klassen van celoppervlakte receptoren. Ze zijn iets anders dan dierenreceptoren, maar hebben een serine/threonine domein en een ligand bindingsdomein aan de buitenkant. Ze worden leucine-rijk herhalingsreceptor kinases genoemd. De Clv1 en Clv2 van Arabidopsis coderen waarschijnlijk voor de hoeveelheid organen en vergrotingen in de plant. Clv3 remt de groei van knoppen als het bindt aan Clv1 en Clv2. Brassinosteroïdes zijn plant moleculen die de groei en differentiatie van cellen reguleren.

Groei regulatoren, ook wel plant hormonen genoemd, coördineren de ontwikkeling van de plant. Ethyleen is een klein gas molecuul en beïnvloedt de plant op vele manieren (rijping, knippen van bladeren, stress, verwondingen, etc.). Hierbij is er een trippel respons: 1) stam wordt dikker, 2) het vormt de uiteindes in een haak structuur zodat het meer grip in de grond heeft en 3) het reduceert de bedoeling om richting het obstakel te groeien.

Auxin zorgt ervoor dat planten richting het licht groeien en dat hun wortels diep in de grond groeien. Het bindt aan receptoren in de celkern en beïnvloedt de genexpressie door middel van afbraak van gen regulerende eiwitten.

Planten moeten zich meer aanpassen aan de omgeving, omdat ze zichzelf niet kunnen verplaatsen. Daarom moeten ze hun energiebron, de zon, goed kunnen gebruiken. Hiervoor maken ze gebruik van foto-eiwitten. Fytochromen komen voor in planten en sommige algen. Ze reageren op rood licht en fosforliseren zichzelf en ook andere cellen om hun heen. Het ‘far-red’ licht inactiveert deze cellen. Waarschijnlijk zijn deze fytochromen geëvolueerd vanuit bacteriële histidine kinases. Cryptochromen zijn gevoelig voor blauw licht. In planten zorgen ze voor een circadiaans ritme en bij dieren zorgen ze voor DNA herstel.

Begrippenlijst Moleculaire biologie

1. Cellen en genomen

2. Celchemie en biosynthese
 

3. Eiwitten
 

4. DNA, chromosomen en genomen
 

5. DNA replicatie, reparatie en recombinatie
 

6. Hoe cellen het genoom lezen: van DNA naar eiwit

7. De controle van gen expressie

15. Cel communicatie