Voor belangrijke formules, zie bijlage.

1. De genetische revolutie in de levenswetenschappen

De genetica gaat over het bestuderen van alle aspecten van genen. Daarbij zijn genen de kern van biologische informatie. De ontdekking van het molecuul deoxyribonucleic acid (DNA) heeft voor de moleculaire genetica gezorgd. De genomica is de studie van de genomen (volledig set van genen).

1.1 Biologische informatie

Doordat levende organismen gebruik maken van informatie uit het DNA, wat nodig is om vorm te geven aan zo een organisme, zijn er sinds het ontstaan van de aarde vele generaties ontstaan. Watson en Crick hebben in 1950 ontdekt dat DNA informatie bevat dat geschreven staat in een genetische code. DNA bevat vier moleculaire bouwblokken (nucleotiden) die een bepaalde volgorde kunnen vormen; wat de taal is van de genetische code.

DNA bestaat uit twee lange strengen nucleotiden, die een dubbele helix vormen. Daarnaast bestaat elke nucleotide uit een suikergedeelte, een fosfaatgroep en een base. De suikergedeelten en de fosfaatgroepen zijn altijd hetzelfde, maar er zijn vier soorten basen. Deze zijn adenine (A), thymine (T), guanine (G) en cytosine (C). Daarbij horen A en T, en G en C bij elkaar.

De complete set van genetische informatie is het genoom. Bij een eukaryoot, organisme met een celkern, zit het genoom in de celkern. Wanneer een celkern voor elk chromosoom, een tweede identiek chromosoom heeft, heet dit diploïde (2n). Wanneer een celkern een enkel chromosoom heeft, en dus geen dubbele, heet dit haploïde (n). Het haploïde aantal kan ook betrekking hebben op een diploïde organisme. Dit getal telt het aantal dubbele chromosomen niet mee. Daarnaast worden de twee identieke chromosomen homologe chromosomen genoemd.

Een organisme codeert met het DNA voor een bepaald gen, maar ook voor een intron. Dit is een pauze tussen de coderende genen. Aangezien homologe chromosomen op het oog hetzelfde zijn, (op moleculair gebied verschillen ze wel iets) zijn er ook genen paren. Nucleosomen worden gebruikt om de chromosomen compact op te rollen; samen heet dit de chromatin. Deze nucleosomen bestaan weer uit acht eiwitten die histonen worden genoemd. Histonen vouwen niet alleen het DNA op, maar bepalen ook of regulerende eiwitten (zie 1.2) hun werk kunnen doen op dat stukje DNA rondom de histoon. Wanneer het DNA gekopieerd wordt, moet de helix tijdelijk uit elkaar. Hier helpt het centromeer bij. De uiteinden van de chromosomen heten telomeren en die houden de chromosomen netjes bij elkaar. In de celkern zit niet alleen het DNA, maar ook andere celorganellen zoals de mitochondriën bijvoorbeeld. Deze heten extranucleaire genomen.

Bij prokaryoten, organismen zonder celkern, zweeft het DNA in het plasma rond. Daarbij zijn de chromosomen haploïde.

1.2 Van informatie naar biologische vormgeving

Wanneer je naar een organisme kijkt zie je eiwitten en het werk van eiwitten: de belangrijkste bouwstoffen in ons lichaam. Er zijn drie soorten eiwitten:

• Structurele eiwitten zorgen voor de fysieke structuur van een organisme zoals haar, nagels, spieren, cytoskelet, et cetera.

• Enzymatische eiwitten zorgen voor de katalisatie van reacties zodat moleculen, eiwitten en hydraten kunnen worden gevormd.

• Regulerende eiwitten zorgen voor het aan- of uitzetten van genen op de juiste plaats en tijd.

De transcriptie van het DNA begint met het overnemen van de informatie door het ribonucleic acid (RNA). De RNA bestaat ook uit dezelfde onderdelen als het DNA, maar uracil (U) vervangt de base thymine. Ook is RNA niet een dubbele helix, maar een enkele streng en de intronen zijn eruit gelaten. Daarna wordt het overgeschreven op het mRNA, waarna het buiten de celkern terecht komt. Hier komt het mRNA langs een ribosoom die de codons (drie basen combinaties) vertaalt naar de juiste aminozuur. Hier komt een polipeptide met heel veel aminozuren uit. Deze codeert dan weer voor een bepaalt eiwit.

Er zijn meerdere soorten RNA. De fundamentele RNA hierboven beschreven, net zoals de messenger RNA. Daarnaast is er de tRNA voor het transporteren en de rRNA voor de ribosomen.

Genomen kunnen zichzelf verdubbelen. De helix gaat hierbij open en de ontbrekende basen worden bij elke aparte helix toegevoegd. Hierdoor ontstaan er twee dochter chromosomen met precies dezelfde informatie.

Variaties in het DNA tussen soorten is een groot discussiepunt in de biologie. Een mutatie is zo een variatie. Dit is door een kleine fout bij de transcriptie van DNA of door omgevingsfactoren. Deze mutaties kunnen doorgegeven worden als het in een sperma- of eicel zit. Deze kunnen dan geërfde ziektes ontwikkelen in de nakomelingen. Non-genetische veranderingen zijn epi-genetisch.

1.3 Genetica en evolutie

Natuurlijke selectie is het proces waarbij individuen met een bepaalde karakteristiek, die bij een bepaalde omgeving hoort, beter kunnen presteren. Deze individuen zullen meer nakomelingen krijgen met deze zelfde karakteristiek, waardoor het aantal individuen mét dat karakteristiek toeneemt. Gelijkheid door eenzelfde voorouder met een andere soort heet homologie. Deze homologie kan in een evolutie boom uitgezet worden. Dit alles, over de natuurlijke selectie, heet de evolutietheorie.

De neanderthaler staat zelfs nog dichterbij ons dan de chimpansee. Deze hebben, net zoals ons, de mogelijkheid gehad om te spreken. Daarnaast zijn de homo sapiens ontstaan in Afrika en zijn verder ontwikkeld in andere delen in de wereld. Genetica heeft bijgedragen aan het begrijpen van de evolutie. De kennis van homologie op DNA level helpt bij het begrijpen van andere soorten.

1.4 Genetica: een krachtige, nieuwe benadering voor biologisch onderzoek

De onderzoeker begint met een onderwerp wat hij/zij graag wil weten. De goede genen worden vergeleken met de slechte genen. Zo kunnen er ontdekkingen gedaan worden over het ontstaan van die mutatie of over andere aspecten. Elk gen kan dan worden geïdentificeerd om zo de code te begrijpen. Dit kan op twee manieren: 1) vooruit genetica en 2) omgekeerde genetica. Vooruit genetica manipuleert een gen uit de natuur door middel van X-rays, chemicaliën of andere producten die mutaties veroorzaken. Vervolgens wordt er gekeken hoe deze mutatie tot uiting komt in nakomelingen. De volgende stap is om het gen en de functie te bepalen. De omgekeerde genetica werkt met een bepaald gen waarvan de locatie al bekend is, maar de functie nog niet. Vervolgens wordt er gekeken wat er gebeurd. Hieruit kan dan de functie bepaald worden.

Onderzoekers kijken over het algemeen naar een gemuteerd gen en hoe dat resulteert in de natuur. Door het DNA te klonen kunnen hiervoor kleine segmenten gebruikt worden. Kleine stukjes gen worden geknipt. Deze worden in een vector gestopt, een huls, die in een levende cel wordt gestopt waardoor die cel dat DNA als zijn eigen overneemt. Zo worden er heel veel cellen, kolonies, gevormd met dat bepaalde gen; dat eventueel gemuteerd is.

Specifieke moleculen in het DNA kunnen worden gedetecteerd door middel van probing (het afzonderen van). Deze methode maakt gebruik van de specifieke inter-moleculaire binding. Een mix van macromoleculen zijn blootgesteld aan een molecuul (de probe), die alleen zal binden aan het gezochte macromolecuul. Dit wordt gedaan terwijl de DNA streng open is zodat er ruimte is om te binden. Deze wordt gelabeld waarna deze gedetecteerd kan worden.

1.5 Model organismen: cruciaal voor de genetische revolutie

Model organismen, zoals muizen, fruitvliegjes, bacteriën en gist, zijn makkelijk te onderhouden en er zijn veel van te verkrijgen in een korte tijd. Daarnaast hebben ze eigenschappen die goed zijn voor onderzoek. Omdat ze zo klein zijn, kunnen ze in grote hoeveelheden gebruikt worden. Bacteriën kunnen ook makkelijk uitgesmeerd worden voor het detecteren van een bepaald gen; wat hierboven beschreven staat. Ook kunnen bacteriële virussen gebruikt worden als vector. Gist en schimmels zijn handig, aangezien hun meiose verdeling in een zakje plaatsvindt. Zo zijn er nog veel meer in het boek verwerkt met vele voordelen.

1.6 Genetica verandert de samenleving

De genetica heeft de agricultuur verandert met haar gemodificeerde voedsel. Daarnaast zijn er ook oneindig veel gencombinaties te maken voor allerlei vakgebieden. De dieren worden gemanipuleerd om te zorgen dat ze beter en/of meer produceren. De medicijnen zijn verbeterd doordat we meer weten waar de ziektes vandaan komen. Ook zijn de wetenschappers bezig met gentherapie: zieke genen vervangen door gezonde genen. De politie werkt met DNA en vingerafdrukken om de boeven op te pakken.

1.7 Genetica en de toekomst

Veel is er al ontdekt in de afgelopen jaren, maar er zijn nog steeds aspecten onduidelijk. De voedselindustrie zal meer moeten gaan produceren om iedereen gevoed te houden. Dit kan mogelijk met de genetica. Verder willen de wetenschappers het DNA vanaf de geboorte goed hebben, oftewel, zonder zieke genen.

2. Enkel-gen erfelijkheid

Wetenschappers hebben het doel om te begrijpen hoe twee geslachtscellen tot een individueel volwassen wezen worden. Dit wordt dan in onderdelen verdeeld om onderzoek te kunnen doen. Hierbij kunnen wetenschappers genen met bepaalde functies ontdekken (gene discovery). De meest gebruikte analyse is de methode enkel-gen erfelijkheid (single-gene inheritance). De erfelijkheid kan bepaald worden uit kruisingen (gecontroleerde paringen) door middel van mutanten (alternatieve eigenschap ten opzichte van normale genen) en het “wild type” (normale genen uit de natuur). Er wordt gekeken hoe de mutant verschilt van het “wilde type”. Maar ook hoe zich dit uit in kruisingen tussen de mutant en “wild type”.

2.1 Enkel-gen erfelijkheidspatronen

De termen karakter en trek worden in de genetica hetzelfde gebruikt als de term eigenschap. Als er een karakter wordt gekozen om te vergelijken, worden er twee of meerdere contrasterende fenotypen gekozen. Een pure lijn houdt in dat, voor elk fenotype van belang, alle nakomelingen zijn geproduceerd door paringen waarbij de familieleden identiek waren. Twee soorten paringen die in het boek worden genoemd zijn: 1) kruisingen en 2) zelfbevruchting. Kruisingen worden gedaan door de stamper van een plant door een andere plant te laten bevruchten door stuifmeel. De zelfbevruchting vindt plaats doordat een plant zijn eigen stamper bevrucht met zijn eigen stuifmeel. Bij het paren heten de ouders P van “parents”. De volgende generatie heet F1, van “filial generation”. De tweede generatie heet F2 en ga zo maar door.

Mendel’s wet van gelijke scheiding:

• Een erfelijkheidsfactor, genaamd gen, is nodig voor het produceren van een erwt-kleur.

• Elke plant heeft een paar van dit gen.

• Het gen komt in twee vormen voor; dit heten een allel (mv. allelen). Deze kunnen aangegeven worden door letters. Voorbeeld: Y of y.

• Een plant kan de allelen Y/Y, y/y of Y/y hebben. Deze allelen zijn homozygoot (Y/Y of y/y) of heterozygoot (Y/y). Deze combinatie van allelen heten genotypen.

• Daarbij zit er een verschil in kracht van de allelen. Y is het dominante gen; wat altijd tot uiting komt. Het allel y is het recessieve gen; wat alleen tot uiting komt als er geen dominant gen aanwezig is.

• De eerste wet van Mendel houdt in dat tijdens de meiose, de leden van het genenpaar zich gelijk scheiden in de sperma- en eicellen.

• Een enkele gameet (sperma- of eicel) bevat een enkel lid van het genenpaar.

• Tijdens de bevruchting, mixen de gameten hun allelen random. Een bevrucht ei heet een zygote.

Het algemene genotype heeft een ratio van 1:2:1. Dit houdt het volgende in: 1/4 is Y/Y, 2/4 is Y/y en 1/4 is y/y. Y/- betekent dat het dominante allel tot uiting komt en waarbij het niet uitmaakt of het streepje ingevuld wordt door een Y of een y. Ook zijn 1:1 en 3:1 ratio’s die door de eerlijke scheidingswet van Mendel kracht krijgen.

2.2 De chromosomale basis van enkel-gen erfelijkheispatronen

Bij het delen van cellen voor het ontstaan van een volgende generatie, horen twee belangrijke delingen: mitose en meiose. Mitose is een geprogrammeerde cyclus van eukaryote celdeling. Hierbij horen de fases G1 (pauze), S (DNA verdubbeling in de cel), G2 (pauze) en M (mitose: de cel met de dubbele DNA informatie deelt in twee cellen, die een enkele DNA informatie bevat). Mitose vindt plaats bij diploïde cellen (2n --> 2n + 2n) en bij haploïde cellen (n --> n + n). Een meiocyte is een cel die zich onderscheidt in een gameet tijdens de meiose. De meiose zorgt ervoor dat alle allelen, van het genenpaar van de ene ouder en van de andere ouder, bij elkaar komen.

Het plaatje 2-8 maakt de fasen van de meiose en mitose duidelijk. Belangrijke begrippen hierbij zijn de dyade (gekopieerde zussen chromosomen samen), bivalent (twee dyaden) en een tetrade (de vier chromatoiden die de bivalent maken). Het einde van de meiose, waarbij vier individuele, haploïde cellen uit zijn gekomen, heet het eindproduct van de meiose. De meiose is samen te vatten in het volgende:

• Start: twee homologen. Een homoloog draagt A en de andere homoloog draagt a.

• Kopiëren: twee dyaden. Een dyade is AA en de andere dyade is aa.

• Paren: tetrade is A/A/a/a.

• Eerste deling: een dyade naar elke dochtercel. In een dochtercel zit AA en in de andere dochtercel zit aa.

• Tweede deling: een chromatide naar elke dochtercel. Hier komen vier cellen uit die A, A, a en a bevatten.

De mitose-fase vindt niet plaats bij een haploïde cel. Twee haploïde cellen vormen samen één cel met beide chromosomen, waardoor deze cel diploïde wordt. Deze chromosomen kopiëren zichzelf waardoor er twee chromosomen paren in één cel zitten. Vervolgens deelt de cel zichzelf waardoor de chromosomen paren in aparte cellen zitten. Deze cellen delen zichzelf, waardoor de cellen weer haploïde worden. Nu zijn er vier haploïde cellen in plaats van twee. Deze vier cellen bevinden zich in de ascus (membraanzak).

2.3 De moleculaire basis van Mendeliaanse erfelijkheidspatronen

Allelen zitten op dezelfde stukjes op een gen, maar hebben verschillende eigenschappen. Een mutatie is een onbedoelde verandering op het allel. Deze mutatie kan overal op het gen plaatsvinden. Op moleculair niveau veranderen hierbij de basen; A&T worden G&C of andersom.

Een manier om de chromosoom segregatie op moleculair niveau te zien, is om de allelen in een volgorde te zien. Een andere manier om een deel van het DNA op te sporen, is de “restriction fragment length polymorphism” (RFLP). Dit is een techniek om variatie op homologe DNA stukjes te zien. De stukjes gen worden gescheiden door enzym locaties. Een andere manier is om te kijken of er verschillen zijn in het DNA, op dezelfde locaties, is de “polymerase chain reaction” (PCR). Deze methode kijkt of er verschillen zijn in het aantal herhalingen van codes. Ook hierbij wordt gebruik gemaakt van moleculaire markers. Dit zijn markers, die niet per se van biologische interesse zijn, maar gebruikt kunnen worden om de erfelijkheid van een chromosoom gedeelte op een specifieke positie te bepalen.

Het eerste fenotype, vanuit het genotype, is het eiwit dat wordt geproduceerd. De meeste mutaties in een aminozuur reeks voor het produceren van een eiwit, resulteren in een functie die toeneemt of juist absent is. Hierbij zijn nul allelen de gemuteerde allelen en lekkende allelen zijn de allelen die bijna hetzelfde eruit zien als de gemuteerde allelen. Wanneer een gen haplosufficient is, dan kan het gen de mutant opvangen en alsnog de juiste functie uitvoeren. Wanneer een gen haploinsufficient is, dan kan het gen de mutant niet opvangen en ook niet meer de juiste functie uitvoeren.

2.4 Sommige genen ontdekt door het observeren van scheidingsratio’s

In het boek worden drie situaties beschreven, waarbij het uiteindelijke resultaat de standaardratio is (1:3:1 of 1:1). Hierdoor kan er bepaald worden, ook mede door de fenotypen, wat de dominante genen zijn en wat de recessieve genen zijn. Dit is gedaan door middel van vooruit genetica. Deze methode volgt een aantal stappen:

• Kies een interessante, biologische eigenschap;

• Zoek mutanten die deze eigenschap beïnvloeden;

• Kijk bij de mutanten naar enkel-gen overdracht;

• Identificeer de tijd en plaats waarbij de genen actie vertonen;

• Zoom in op de moleculaire level van het gen door middel van DNA analyse.

Een manier om erachter te komen wat de allelen zijn van de ouders, is om de ouder te kruisen met een bekende recessieve ouder met de allelen a/a (tester). Deze manier heet test kruisen. Als het genotype van de onbekende ouder A/a is, dan zal er 1/2 A/a en 1/2 a/a uitkomen. Als het genotype van de onbekende ouder A/A is, zullen alle nakomelingen het dominante gen laten zien. Het is een makkelijke methode om iets ingewikkelds te begrijpen. Ook de meiose kan negeert worden hierbij, aangezien de gameten recessief zijn en dus niet bijdragen aan het fenotype van de nakomelingen.

Je kan dus de principes van overdracht in twee richtingen gebruiken: 1) het afleiden van genotypen vanuit fenotypische ratio’s en 2) het voorspellen van fenotypische ratio’s van ouders met een bekende genotype.

2.5 Sekse gerelateerde enkel-gen erfelijkheidsspatronen

Naast autosomale (niet geslachtsgebonden genen) hebben zijn er ook wezens met sekse chromosomen. Deze bepalen of het wezen een mannetje of een vrouwtje is. Bij mensen is het vrouwtje met twee X chromosomen (homogametisch) en het mannetje heeft een X- en een Y-chromosoom (heterogametisch). In de meiose paren en scheiden de X-chromosomen als autosomale chromosomen zodat elk ei een X-chromosoom bevat. Bij het mannetje gaat het niet autosomaal, maar de ene helft van het sperma bevat het Y-chromosoom en de andere helft het X-chromosoom. Dioecious (tweehuizig) soorten zijn planten die sekse-gerelateerde eigenschappen hebben, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen mannelijke en vrouwelijke planten.

De sekse chromosomen, X en Y, hebben gebieden die verschillen van elkaar (differentiaal regions). Ook hebben ze twee pseudoautosomale gebieden. Één, of beide gebieden, paren tijdens de meiose en kruizen over. Hierdoor kunnen ze zich gedragen als één. Sekse linkage houdt in dat één van de twee X- of Y-chromosomen, glijden naar de gemuteerde versie.

2.6 Humane stamboom analysen

Bij mensen is het moeilijker om genen te kruisen, waardoor er gebruik gemaakt wordt van stambomen. Deze bevatten vaste symbolen om een bepaald fenotype van een familie te uiten. Deze familie heet een propositus. De ziekte, dit is dan het fenotype, kan in twee vormen voorkomen: absent of present. Er zijn vier soorten patronen van enkel-gen erfelijkheidspatronen:

• Autosomale, recessieve ziektes. Dit fenotype is present wanneer de allelen recessief zijn a/a. Als er een dominant allel bijzit, heterozygoot of homozygoot, dan is het fenotype absent. Twee voorwaarden hiervoor zijn: 1) het fenotype komt voor bij nakomelingen van gezonde ouders en 2) de nakomelingen kunnen meisjes of jongens zijn. Deze vorm van erfelijkheidspatronen komt niet vaak voor.

Autosomale, dominante ziektes. Hierbij komt de ziekte in elke generatie voor. Ook erven de kinderen (meisjes en jongens) de ziekte van beide ouders.

• Autosomale polymorfismes. Hierbij zijn er allelen die meerdere fenotypen kunnen hebben. Denk hierbij aan blauw of bruine ogen, of aan vaste oorlellen of vrije oorlellen. De simpelste, en meest voorkomende, morf is dimorfisme. Daarbij zijn er twee mogelijkheden.

• X-linked recessieve ziektes. Er zijn drie belangrijke punten bij deze vorm. 1) Veel meer mannen erven dit fenotype. Dit komt doordat het meisje het zieke allel van de moeder en de vader moet erven voor de ziekte, en de jongen alleen als de moeder het zieke allel draagt. 2) Geen enkele nakomelingen van een man vertonen het zieke fenotype, maar alle meisjes zijn dragers. In de generatie daarna zullen de mannen voor de helft ziek zijn. 3) Geen enkele zoon van een zieke vader kan het zieke allel erven. Dit komt doordat de zoon het Y-chromosoom van zijn vader erft.

X-linked dominante ziektes. Zieke mannen geven het gen door aan al hun dochters, maar niet naar hun zonen. Zieke, heterozygote vrouwen die kinderen krijgen met een gezonde man, geven aan de helft van hun zonen en dochters het gen.

• Y-linked overerving. Alleen mannen kunnen deze ziektes overerven, aangezien vrouwen geen Y-chromosomen hebben.

3. Onafhankelijke verscheidenheid bij genen

Dit hoofdstuk gaat over de enkel-gen erfelijkheid, waarbij meerdere genen tegelijkertijd worden geanalyseerd. Dit is vooral belangrijk geweest voor het toenemen van de voedselproductie.

De chromosomen paren handelen onafhankelijk van elkaar tijdens de meiose en de allelen van twee heterozygote genen paren laten een onafhankelijk aanbod (independant assortment) zien.

3.1 Mendel’s wet van onafhankelijk aanbod

Naast monohybride (A/a), zijn er ook dihybrides (A/a * B/b) die gebruikt kunnen worden om dyhibride kruisingen te doen (A/a * B/b x A/a * B/b). Bij Mendel kwam ook hier een bepaald ratio uit, deze was 9:3:3:1. Dit is te verklaren uit het feit dat de twee monohybrides de ratio’s 3:1 hebben. Dit zit vervolgens verstopt in het ratio 9:3:3:1. Alleen dit zijn slechts cijfers. Wat betekent dit in de biologische zin? Dit is geformuleerd in de tweede wet van Mendel (het principe van onafhankelijk aanbod): genen paren op verschillende chromosomen en sorteren onafhankelijk tijdens de meiose.

3.2 Werken met een onafhankelijk assortiment

Er zijn verschillende manier om de genotype in schema te brengen en te berekenen. De eerste is om gebruik te maken van een tabel. De tweede is om gebruik te maken van een boomdiagram. Daarnaast werkt genetica met twee andere vormen voor het berekenen van de ratio’s: 1) de genotypen van de ouders voorspellen op basis van nakomeling ratio’s en 2) de genotypen van de nakomelingen voorspellen op basis van de bekende genotypen van de ouders. Bij deze berekeningen horen de productregel (de kans op onafhankelijke gebeurtenissen die tegelijkertijd voorkomen, is hun individuele kansen maal elkaar; a en A) en de somregel (de kans op de twee gebeurtenissen die mutually exclusive zijn, bij elkaar opgeteld; a of A).

De kans op het berekenen van een specifiek genotype, bv. a/a,b/b,c/c,d/d,e/e, gaat als volgt. Stap 1 is om voor elk fenotype uit een kruising de kans te berekenen op de benodigde kans. Dus uit A/a x A/a bereken je de kans dat hier a/a uitkomt. De kans op dit genotype is 1/4. Vervolgens bereken je dit percentage van elk genotype kruising; om dit vervolgens met elkaar te vermenigvuldigen aangezien de genotypen allemaal tegelijk voor moeten komen.

Ook is er een berekening om te berekenen hoeveel planten je nodig hebt om het genotype van je wil, ook echt te krijgen. Bereken hierbij de kans dat je dat genotype niet krijgt in je planten (1-kans op gewild genotype). De formule voor het berekenen van het benodigd aantal planten is: 1 - (kans op de verkeerde genotypen/kans op gewilde genotype)^n = 0,95. Verder wordt er in de biologie ook gebruik gemaakt van de Chi-kwadraat test gebruikt om significantie van resultaten te testen.

Herhaaldelijke zelfbevruchting bij planten leidt tot een verhoogde proportie van homozygoten. Deze zijn vaak nodig voor een bepaalde soort in de agricultuur, waardoor deze methode ook veel wordt gebruikt. Door de vele zelfbevruchtingen worden er ook zuivere lijnen gecreëerd. Dit is handig voor onderzoek.

Geliefd door boeren zijn de hybride zaadjes. Dit zijn twee pure lijnen gecombineerd. Op moleculair niveau is hier verder nog niet veel bekend over, maar het is in ieder geval heterozygoot. Deze zaadjes zijn extra krachtig en zorgen voor beter, meer en grotere oogsten. Een nadeel is dat deze expres gekruist moeten worden. Terwijl de pure lijnen door zelfbevruchting rustig kunnen doorgroeien. Een ander nadeel is dat de meiose het gewilde genotype opbreekt, waardoor de volgende generatie hybrides maar een klein deel de goede eigenschappen hebben. Hierdoor moeten de kruisingen steeds opnieuw plaatsvinden.

3.3 De chromosomale basis van onafhankelijk assortiment

Onafhankelijke scheiding vindt in de meiose plaats. Dit is wanneer de chromosoom paren van elkaar worden getrokken in de anafase. De verschillende paren hebben allemaal een gelijke kans om in een nieuwe cel samen te komen. Dit is aangetoond in het onderzoek van Carothers met sprinkhanen. Deze hebben een speciaal chromosomen, die niet verdubbelen, waardoor dit fenomeen opgespoord kan worden. Normaal gesproken is dit erg lastig. Voor extra duidelijkheid is plaatje 3-8 op bladzijde 91 belangrijk. Deze onafhankelijke scheiding vindt ook plaats bij de haploïde schimmel neurospora. Deze is handig om te gebruiken, aangezien elk haploïde chromosoom direct tot uiting komt. Er zijn hier natuurlijk gen variatie mogelijkheden bij.

Het principe van onafhankelijk assortiment is ook handig voor het analyseren van heterozygote genotypen voor autosomale genen als voor X-chromosomale genen.

Het vormen van nieuwe allelen combinaties heet recombinatie. Een verklaring voor recombinatie is dat het goed is voor de variatie in een organisme. Een meiotische recombinatie is een haploïde gen dat nieuwe combinaties maakt met allelen die samenkwamen, om de meiotische uitkomsten te maken. Hierbij wordt de input (n n) vergeleken met de output (2n). Dit is, zoals eerder genoemd, makkelijker te detecteren bij haploïde organismen. Bij diploïde organismen is dit lastiger te zien, aangezien niet elk genotype tot uiting komt. Om de input te weten bij diploïde organismen wordt er gebruik gemaakt van zuivere diploïde ouders, die maar één gameet kunnen produceren. Om de output te weten bij diploïde organismen, wordt er gebruik gemaakt van test kruisingen waarbij de nakomelingen bekeken worden. Recombinatie vindt plaats tussen verschillende chromosomen door onafhankelijk assortiment en tussen genen op dezelfde chromosomen door crossing over. Een recombinant frequentie van 50% laat zien dat de genen onafhankelijk scheiden en dat deze genen op andere chromosomen liggen.

3.4 Polygenetische overerving

Er zijn ook numerieke variaties. Deze kunnen elke mogelijk waarde aanname tussen bepaalde waardes. Denk hierbij aan de lengte van een persoon. Deze variaties kunnen in een normaal verdeling gezet worden. Deze genen heten polygenen of ‘quantative trait loci’ (QTL). Deze genen kunnen verschillende doseringen aangeven. Een voorbeeld is r/r geeft 0 doseringen aan, R/r of r/R geven 1 dosis aan en RR geeft twee doseringen aan.

Het begrijpen van dit soort genen is een uitdaging voor de genetica in de 21e eeuw. Deze polygenen zorgen voor ziektes zoals atherosclerosis of hypertensie.

3.5 Organel genen: overerving onafhankelijk van de celkern

Naast het DNA in de celkern, zit er ook DNA in de mitochondriën. Bij planten zit dit ‘extra’ DNA in de chloroplasten. Dit DNA is onafhankelijk over geërfd van de celkern. Dit wordt ook wel extrakernige overerving genoemd. De mitochondriën, en chloroplasten, bevatten DNA, maar de oorsprong hiervan is nog een mysterie. Iets anders dat opvalt, is dat elk organel vele malen voorkomt in de cel. Het mitochondrische DNA en het chloroplast DNA is in kaart gebracht. Daarbij valt op dat het heel dicht op elkaar is gebouwd en dat er ook introns zijn. Een opmerking bij dit ‘extra’ DNA is dat normaal DNA voor eiwitreacties codeert en dit DNA geeft reacties in de chloroplasten door fotosynthese en zuurstof met fosfor in de mitochondriën.

Organellen laten hun eigen speciale overerving zien: uniparental overerving. Dit houdt in dat ze DNA krijgen van één ouder en dat is meestal de moeder (maternal overerving). Dit komt doordat de moeder plasma mee produceert en de vader niet. Ook hierbij kan gekeken worden naar mutanten om de overerving te detecteren. Cytoplasmatische overervingspatronen zien er als volgt uit: vrouwelijke mutant x mannelijke + geeft dat alle nakomelingen mutanten zijn en vrouwelijke + x mannelijke mutant geeft dat alle nakomelingen + zijn.

Er zijn ook stambomen die ziektes door vrouwen doorgegeven en verkregen zijn, laten zien. Dit patroon suggereert dat er cytoplasmatische mutaties zijn en wijst naar mutaties in het mitochondrische DNA.

4. Het in kaart brengen van eukaryote chromosomen door middel van recombinatie

Onderzoekers willen de vragen over genen, presentie van genen, welke functies ze hebben en waar ze op het chromosoom liggen, beantwoorden. De locatie kan bekeken worden door het in kaart brengen van genenkaarten. Hier zijn drie belangen bij:

1. Genpositie is informatie die cruciaal is om een ingewikkeld genotype te bouwen, voor experimentele en commerciële belangen.

2. De genpositie is ook belangrijk bij het begrijpen van de structuur en functie.

3. Hoe de genen in elkaar zitten, kan helpen bij het ontdekken van evolutionaire processen. Hierbij kan gekeken worden hoe we afstammen van de apen en wanneer dit heeft plaatsgevonden.

Een chromosonenkaart laat de loci (enkelvoud: locus) van de genen op dat chromosoom zien. Er zijn twee soorten basis chromosoom kaarten. Degene die wordt besproken in dit hoofdstuk is de recombinatie kaart. Deze genen worden geïdentificeerd door middel van mutant fenotypen die enkel-gen overerving laten zien. De andere chromosoom kaart wordt gemaakt door middel van fysieke kaarten. Deze laat de segmenten van DNA op het chromosoom zien.

4.1 Diagnostiek van linkage

Recombinatie kaarten van chromosomen worden meestal samengesteld van twee of drie chromosomen met de methode linkage analyse: de loci van de genen liggen op hetzelfde chromosoom. Hierdoor zijn de allelen op een homoloog fysiek samengesteld, linked, door het DNA tussen hun in.

Morgan heeft getest of er zulke linkage bestond, aangezien er al enige hypothesen daarover waren. Hij deed een testkruising, waarbij de fenotypen van de nakomelingen direct de allelen laten zien die van belang zijn. Hieruit kwam totaal niet een ratio van 1:1:1:1. Er is te zien dat twee genotypen veel vaker voorkomen en waarschijnlijk elkaar aansporen om tot uiting te komen.

Een andere manier om dit te zien, is om te kijken naar het aantal recombinanten in een tweede kruising. Hierbij wordt F1 gekruist met een tester. De geproduceerde gameten laten eveneens zien dat er waarschijnlijk linkage heeft plaatsvonden, aangezien deze samen veel vaker voorkomen dan de andere twee genotypen.

Wanneer twee genen dus dicht bij elkaar liggen op hetzelfde chromosomen paar, dan zijn ze gelinked. Ze scheiden niet onafhankelijk, maar produceren een recombinant frequentie lager dan 50%. Vandaar, dat omgekeerd, een recombinant frequentie lager dan 50% een diagnostiek is voor linkage.

Een verklaring voor de recombinanten bij linkage, is crossing over. Hierbij liggen de chromatiden dicht op elkaar, waardoor ze een stukje gen overkruisen met het andere chromosoom. Chiasma (meervoud: chiasmata) is het zichtbare gedeelte van de crossovers. Het werk van Morgan liet zien dat linked genen in een dihybride kruising kunnen voorkomen in één van de twee basis overeenstemmingen. In eentje, de twee dominante of wild type allelen, komen voor op dezelfde homoloog. Dit heet een cis overeenstemming. Bij de andere conformatie, liggen de allelen op verschillende homologen. Dit wordt een transconformatie genoemd. Een aantal belangrijke punten over de weergave van conformaties:

• Allelen op dezelfde homoloog, cis, hebben geen interpunctie tussen elkaar. Bijvoorbeeld Aa.

• Een schuin streepje (/) scheidt de twee homologen. Bijvoorbeeld Aa/Bb.

• Allelen zijn altijd geschreven in dezelfde volgorde op elke homoloog.

• Genen die niet linked zijn en dus op verschillende homologen liggen, worden gescheiden door een schuin streepje. Bijv. A/a.

• Genen waarvan de linkage onbekend is, worden de allelen gescheiden door een punt. Bijvoorbeeld A/a . D/d. De linkage wordt op deze manier in dit boek aangegeven, maar dit kan verschillend zijn in een ander boek.

Creighton en McClintock hebben het crossing over-proces aangetoond met maïs. Maïs bevat genen die zich onderscheiden door hun uiterlijk. Één gen bevat een knop aan de ene kant en een staart aan de andere kant. Bij een testkruising is gekeken of de knop en de staart aan hetzelfde gen bleven. Dit was niet het geval. De staart was aan een andere homoloog kan liggen en de knop had daarvoor een ander stukje gen voor in de plaats gekregen. Een cross over gebeurt door het breken van twee DNA moleculen op dezelfde positie, waarna het hervatten van de connectie resulteert in twee onderlinge recombinant combinaties.

Bewijs voor het aantonen dat crossing over plaatsvindt tussen chromatiden, is gevonden bij schimmels en algen. Tetradenanalyse van kruisingen, waarbij genen linked zijn, laten veel tetraden zien die vier verschillende allel combinaties bevatten. Bijvoorbeeld: kruising van AB x ab geeft AB, Ab, aB en ab. Dit resultaat kan alleen verklaard worden wanneer crossing over plaats vindt in het vier-chromatide stadium. Als crossing over plaats vindt in het twee-chromosoom stadium, dan kan er alleen maar een maximum van twee genotypen zijn in een individuele tetrade. Om dit te zien, is plaatje 4-5 op bladzijde 121 handig.

Ook kunnen er in sommige individuele meioses, verschillende cross-overs plaatsvinden op een chromosomen paar. Daarnaast kan er in elke meiose, deze meerdere cross overs informatie uitwisselen tussen meer dan twee chromatiden.

4.2 Kaarten maken door recombinant frequentie

Hoe verder genen van elkaar afliggen, hoe sneller er cross over plaatsvindt en hoe groter de proportie van de recombinantproducten is. De proportie recombinanten ligt aan de afstand tussen twee genloci op een chromosoom kaart. Dit is uiteindelijk bewezen door Sturtevant, een student van Mendel. Doordat het aantal recombinanten ligt aan het feit hoe ver de genen van elkaar liggen, heb je al een afstandsindicator; volgens Sturtevant. Hierdoor is de linkage kaart geproduceerd. Sturtevant heeft de ‘genetic map unit’ (m.u.) als volgt geformuleerd: één m.u. is de afstand tussen genen waarvan één van de honderd producten vanuit de meiose recombinant is. Voorbeeld: De recombinantie frequentie (RF) is 10.7% is definieert als 10.7 m.u. of centiMorgan (cM).

Een drie-punt testkruising of een drie-factor kruising wordt gebruikt voor linkage analyse. Hierbij wordt een trihybride (driedubbele heterozygoot) gekruist met een trihibyde tester. Uit de kruising met de ouders, worden de gameten gevormd. Vervolgens worden de gameten gekruist waardoor F1 ontstaat, die weer met een recessieve trihybride gekruist wordt. Hier komen ook weer gameten uit die vergeleken worden met de ouders. Elke andere combinatie, ten opzichte van de ouders, is een recombinant. Daarbij zijn de loci linked als de RF lager is dan 50%. Ook de genen met de grootste RF waarde, zijn de genen die het verst van elkaar af liggen. Andere belangrijke punten zijn:

• Doordat de genen volgorde en de linkage niet bekend zijn, wordt er eerst een lijst opgesteld. Maar deze kan arbitrair zijn, aangezien je de bovenstaande factoren simpelweg nog niet weet.

• In het diagram maakt het niet uit of de genen v+ of c rechts of links staan.

• Op linkage kaarten wordt de genloci in relatie tot het andere gen bepaalt. Niet precies op welk chromosoom of de precieze afstand.

Er zijn bij een trihybride kruising eigenlijk maar drie mogelijkheden. Elke mogelijkheid heeft een ander gen in het midden. Om dit in beeld te brengen is figuur 4-12 op bladzijde 128.

Cross over vindt plaats waarbij de naastgelegen buren geïnhibeerd worden om ook te overkruisen. Dit wordt inferentie genoemd. Voorbeeld: bij genen v-ct-cv wordt er gekeken of de cross over onafhankelijk is. Hierbij worden de RF van v-ct en de RF van ct-cv met elkaar vermenigvuldigt. Hier komt een waarde uit die met de steekproefgrootte wordt vermenigvuldigt. Deze waarde, de verwachte waarde, wordt vergeleken met de echte waarde uit de steekproef. Als deze waardes gelijk zijn, dan zijn de genen onafhankelijk en is er geen inferentie. Als deze waardes niet gelijk zijn, dan zijn de genen afhankelijk en is er geen inferentie. Een cross over verlaagt de kans op een cross over in een naastgelegen gebied. De formule is:

I = 1 - coëfficient of coincedence (c.o.c) met

c.o.c = geobserveerde waarde / verwachte waarde

Er worden bij fruitvlieg kruisingen alleen vrouwtjes gebruikt als de ‘waardevolle’ genen, aangezien de mannelijke fruitvliegjes geen cross over laten zien.

4.3 Kaarten maken door middel van moleculaire markers

Is geen tentamenstof

4.4 Centromeer kaarten met lineaire tetraden

Centromeren zijn geen genen, maar gebieden op het DNA die van belang zijn voor de reproductie en daarom ook interessant voor de genetica. In de meeste eukaryoten kunnen centromeren niet gebruikt worden als markers, omdat ze niet heterozygoot zijn. Bij schimmels, zoals de neurospora, kan dat wel. Deze produceren de dochtercellen in een strak zakje, een ascus. Wanneer er cross over heeft plaatsgevonden, dan heeft de octade een genvolgorde van AAAAaaaa of aaaaAAAA. Dit wordt eerste deling segregatie patroon genoemd (M1), omdat de twee verschillende allelen scheiden in de twee dochterkernen in de eerste deling in meiose. De andere vier octaden zijn wanneer er wel crossing over plaatsvindt. De volgorde van de genen zijn dan AAaaAAaa, aaAAaaAA, AAaaaaAA en aaAAAAaa. Dit wordt twee deling segregatie patronen (M2) genoemd, omdat dit het resultaat is van crossing over in het gebied vanaf het centromeer naar het gen. De M2 frequentie is nog niet het aantal map units van het centromeer. Aangezien een crossing over in elke meiose resulteert in maximaal 50% procent recombinanten, moet het M2 percentage gedeeld worden door twee.

4.5 Gebruik maken van de Chi-kwadraat test voor linkage analyse

Soms werkt de regel ‘genen zijn linked als de RF op hetzelfde chromosoom lager dan 50% is’ niet. Hiervoor wordt een significantie toets gebruikt. De nulhypothese is: er is geen sprake van linkage. Deze is zo gevormd, aangezien er geen specifieke waarde voor linkage is. Deze kan namelijk 10, 45 of 1 m.u. zijn. De alternatieve hypothese is: er is wel sprake van linkage.

In het boek staat een uitgebreid voorbeeld met het gebruik maken van de Chi-kwadraat. Dit voorbeeld is te vinden op bladzijde 137-139.

4.6 Rekening houden met onvoorziene cross overs

Bij drie-punt testkruisingen, resulteren ouderlijke chromatiden, niet recombinant, door dubbele cross overs. Deze worden hierdoor niet meegerekend bij de recombinant frequentie. Dit leidt tot de situatie dat alle kaart afstanden, gebaseerd op recombinant frequenties, misschien wel onderschattingen zijn van fysieke afstanden. Deze worden dan niet meegerekend, aangezien ze hetzelfde eruit zien als de ouderlijke genen.

Een manier om te schatten hoevaak het bovenstaande gebeurt, wordt de methode kaart functie gebruikt. Deze methode is bedacht door Haldana. De kaart functie methode bevat een formule dat een geobserveerde recombinant frequentie relateert aan een kaart afstand, gecorrigeerd voor meerdere cross overs. Er wordt gekeken wat het gemiddelde aantal cross overs moet zijn geweest bij een bepaalde RF. Dit wordt vervolgens vergeleken met hoeveel cross overs er eigenlijk zijn. Hierbij is het van belang om nul aantal cross overs ook mee te berekenen en ook om te vergelijken met meerdere cross overs.

Er worden nog meer methoden besproken verder in de paragraaf, maar dit is geen tentamenstof en wordt dus ook hier niet beschreven.

4.7 Gebruik maken van kaarten op basis van recombinatie in samenwerking met fysieke kaarten

Recombinatie kaarten laten de loci van genen waarvan de mutant allelen gevonden zijn. Deze posities op een kaart zijn bepaald op basis van de recombinatie frequentie tijdens de meiose. Fysieke kaarten zijn kaarten van de basen in het DNA. Deze laten de basenvolgorden zien en daarbij hoe groot de genen zijn, waar ze zijn en andere interessante dingen. Deze volgorden worden vergeleken met al eerder gevonden basen volgorden waarvan de functie bekend is. Hierbij kan de functie misschien wel gelijk zijn.

Er kan gedacht worden ‘Waarom maken we dan nog gebruik van recombinant kaarten, als de fysieke structuur al bekend is?’. De samenwerking tussen recombinantie- en fysieke kaarten kunnen biochemische functies van een gen identificeren, door middel van het gemuteerde fenotype.

4.8 Het moleculaire mechanisme van crossing over

Crossing over is een speciale uitwisseling van DNA tussen chromosomen waarbij geen DNA verkregen of verloren gaat. Crossing over wordt bestudeerd, alweer, door schimmels. Sommige schimmels geven het resultaat in een octade met een ratio van 5:3. Hierbij zijn er dus teveel sporen van het ene allel en te weinig sporen van het andere allel. Een ander punt is dat het sporenpaar niet identiek is. Deze observatie, van een non-identiek zussen sporen paar, suggereert dat het DNA van een van de vier meiotische homologen resultaten heteroduplex DNA bevat. Heteroduplex DNA houdt in dat er ergens in het DNA een verkeerd basenpaar zit. Tijdens de replicatie wordt dit weer opgelost, aangezien het DNA vervolgens wel weer netjes aan zijn eigen basen connectie (A-T en G-C) bindt.

5. De genetica van bacteriën en hun virussen

Het begrijpen van de huidige genetica is voornamelijk te danken aan de genetica van de bacteriën. Bacteriën behoren tot de prokayroten. Een opvallend kenmerk van de prokaryoten is dat het DNA niet in in een membraan ligt, maar los in de cel. Ook bestaat het DNA uit chromosomen, maar dan allemaal in een cirkel aan elkaar gebonden. Bacteriën kunnen opgenomen worden door een specifiek soort virus: de bacteriofaag. Deze slokt de bacterie op en gebruikt de machinekamer van de bacterie. Daarbij worden virussen niet gezien als levend, aangezien zij dus andere organismen moeten gebruiken om voort te planten. Bacteriën delen zichzelf, waardoor er twee cellen ontstaan. Ook delen ze informatie uit met mede bacteriecellen. Dit gebeurt op vier manieren, waarbij altijd één stuk DNA met een ander stuk DNA in contact met elkaar worden gebracht:

• Conjugatie: contact en samenvoeging van twee verschillende cellen. Een donorcel kan dan een deel van zijn DNA naar de andere cel sturen, waarbij dit opgenomen kan worden door de cel. Dit kan ook plaatsvinden met plasmide (extragenoom DNA).

• Transductie: sommige fagen kunnen een stukje DNA opvangen en dit bij een andere bacteriecel injecteren, waarbij het in het DNA opgenomen kan worden.

• Transformatie: DNA wordt opgevangen uit de omgeving door een bacteriecel en voegt dit toe aan zijn eigen DNA.

• Faagrecombinatie: fagen kunnen zelf recombinatie ondergaan wanneer twee verschillende genotypen één bacteriecel infecteren.

5.1 Werken met micro-organismen

Zoals eerder genoemd, zijn bacteriën goed voor onderzoek aangezien ze in grote getalen voorkomen en makkelijk te onderhouden zijn. Platen maken kan door middel van agar, waarna dit wordt uitgestreken met een steriele spreider. Een kolonie wordt gevormd door vele bacteriën die een beetje op dezelfde plek blijven zitten, aangezien ze niet kunnen bewegen. Cel kolonies zijn kolonies met allemaal dezelfde genetische voorganger. Een wilde type bacterie is prototrofisch: kunnen zelf groeien en delen op een minimaal medium. Dit bevat alleen anorganisch materiaal: zout, koolstofbron voor energie en water. Auxotrofen mutanten kunnen alleen groeien en delen als er een extra stofje wordt toegevoegd aan de agar. Deze stofjes zijn adenine, threonine of biotine. Resistente mutanten kunnen groeien ookal zit er een inhibitor naast.

5.2 Bacteriële conjugatie

De vraag werd gesteld of bacteriën ook enige symptomen lieten zien voor seksuele voortplanting en recombinatie. Dit is beantwoord door een onderzoek van Lederberg en Tatum waarbij de E. Coli gebruikt werd. De staarten van de E. Coli konden alleen groeien met bepaalde extra stoffen en waren dus auxotrofe mutanten. De twee vormen van E. Coli met de zogenaamde staarten werden samengevoegd op een medium waarop ze niet konden groeien. Het resultaat liet zien dat er kolonies waren gegroeid. Dit toont aan dat er een wild type tussen zat, want die kunnen wel op een minimaal medium groeien. Het suggereerde daarbij dat er een soort recombinatie had opgetreden.

De donorcel geeft dus DNA weg aan een ontvangende cel. Hayes ontdekte dat het donor-eigenschap doorgegeven kon worden aan andere ontvangende cellen. Ook kon een donor-cel deze eigenschap verliezen en weer terugkrijgen door andere donor-cellen. Deze bevruchtigsbaarheids (fertility) factor wordt aangegeven door het hebben van deze factor (F+) en door het missen van deze factor (F-). F is een rond plasmide DNA molecuul. Deze stimuleert de groei van pili (enkelvoud: pilus): contacten die projecties die contact initiëren met een ontvangende cel. Het F DNA wordt gekopieerd in een rollend circulaire replicatie, waarna de kopie naar de ontvangende cel wordt gestuurd.

Een belangrijke doorbraak kwam van Cavalli-Sforza. Hij ontdekte een afgeleide van de F+ met twee eigenaarde eigenschappen:

1. Gekruiste F- cellen produceerde nieuwe staarten die 1000 keer meer recombinanten dan een normale F+ staart. Vandaar dat deze afgeleide de naam “high frequency of recombination’ (Hfr).

2. Uit kruisingen tussen Hfr x F- waren de ouders niet veranderd in een F+ of Hfr. Dit is in contrast met de kruising van F+ x F- waarbij vele F- ouders F+ ouders worden.

Het Hfr gen is duidelijker onderzocht door Wollman en Jacob. Zij hebben op verschillende tijdstippen steekproeven genomen en deze op verschillende tijdstippen gemixt, waardoor het paren onderbroken werd. Deze werden vervolgens op een medium geplaatst dat Hfr cellen doodt. Als een cel toch een eigenschap van dit Hfr heeft, dan heeft er conjugatie plaatsvonden. Dit wordt exconjuganten genoemd. De uiteindelijke punten die hierbij belangrijk zijn: 1) elk donor allel verschijnt eerst in het F- ontvangcellen op een specifiek tijdstip nadat het paren was begonnen, 2) de donor allelen verschijnen in een specifieke volgorde en 3) latere donor allelen komen minder vaak voor in ontvangende cellen. Het Hfr-chromosoom, van oorsprong circulair, produceert een lineair stukje DNA van zichzelf. Dit wordt getransporteerd naar de F- cel in een lineaire formatie. Het laatste stukje daarvan bevat de F-factor. Om dit in beeld te brengen, is plaatje 5-12 op bladzijde 168 handig.

Campbell kwam met een hypothese dat de verschillende Hfr kaarten kon verklaren. Hij zei dat als F een ring is, dan moet de tussenvoeging door een simpele cross over tussen F en een bacterieel chromosoom zijn. De terminus is aan de andere kant van waar de F-factor zit. De oriëntatie waarin F is ingevoegd, moet de orde van de donorallelen bepalen. Denk hierbij aan de volgorde ABCD. De volgorde kan ook DCBA zijn.

De F-factor kan dus in twee fasen voorkomen: 1) de plasmide fase als een cytoplasmisch element waarbij F makkelijk getransporteerd kan worden naar F-, ontvangende, cellen en 2) de geïntegreerde fase waarbij F bij een circulair chromosoom hoort.

Recombinant frequentie kan gebruikt worden voor het fine tunen van chromosoom kaarten van bacteriën. De recombinatie van bacteriën vindt plaats tussen een compleet genoom, van het F- gen, dat endogenoten heten en een incompleet genoom; gemaakt van een Hfr donor en het wordt een exogenoot genoemd. De cel is nu gedeeltelijk diploïde (merozygoot), aangezien het een deel van DNA in het endogenoot zit en het andere deel in het exogenoot. Recombinatie gedurende de conjugatie resulteert van een dubbele-cross over-achtig gebeuren, waarbij maar één overleeft.

Het DNA van een F’ plasmide cel bevat gedeeltelijk het DNA van de F-factor en gedeeltelijk het DNA van de bacterie. De F’ plasmide heeft dezelfde eigenschap als de F-factor: ze transporteren snel. Deze cellen zijn handig voor bacteriële dominantie en allel interactie doordat ze gedeeltelijk diploïde zijn.

Er zijn bacteriën, die door het overleven, resistent kunnen worden voor antibiotica. Deze resistentie kan snel verspreidt worden onder de populatie. Dit is uiteraard geen goed teken voor de ziekenhuizen. Deze resistentie is te danken aan de R plasmide en worden snel doorgegeven door conjugatie. Hier zitten de allelen voor resistentie vaak op een eenheid dat transposon wordt genoemd. Door conjugatie kunnen hierbij ook nieuwe allelen opgenomen worden, maar ook weer losgelaten worden.

5.3 Bacteriële transformatie

Door verschillende processen, onder het beleid van transformatie, kunnen cellen hun DNA voorgoed veranderen. Conjugatie gaat door middel van contact, maar bij transformatie wordt loszwevend DNA opgenomen waarna het als eigen DNA wordt gezien. Deze methode wordt gebruikt om het DNA te manipuleren voor bepaalde doeleinden.

5.4 Bacteriofagen genetica

Het vinden van een specifiek en zeldzaam genetisch event wordt gevonden door de methode ‘selective system’. Hierbij wordt alleen hetgeen dat gezocht wordt, zichtbaar. Een tegenovergestelde methode is de ‘screen’-methode. Hier zoeken vele individuen naar het specifieke en zeldzame event. Recombinanten tussen faagchromosomen kunnen bestudeerd worden door het aantal ouder-chromosomen samen te brengen. Dit wordt gedaan door ze samen te brengen in een gastcel door ‘mixed infection’. Faagnakomelingen kunnen bekeken worden op ouderlijke- en recombinante genotypen.

5.5 Transductie

Is geen tentamenstof

5.6 Fysieke kaarten en linkage kaarten vergeleken

Is geen tentamenstof

6. Genen interactie

Genen interacties kunnen bepaald worden door verschillende methoden. Een manier is om door middel van in vitro een ‘eiwit-aas’ te injecteren en te kijken welke andere eiwitten daar op reageren. Een andere manier is om mRNA transcripties te analyseren op moleculair niveau. Dit wordt verder behandeld in hoofdstuk 15. In dit hoofdstuk zal het gaan over het vormen van een fenotype door middel van genetisch analyse.

Genen interacties kunnen in twee categorieën verdeeld worden: 1) interactie tussen allelen voor dominantie of recessiviteit en 2) interactie tussen twee of meerdere loci voor een specifieke biologische functie.

6.1 Interactie tussen de allelen van een enkel-gen: variaties in dominantie

De bekende gemuteerde allelen en de wilde type allelen worden als meerdere allelen of allel series aangeduid.

Een volle, of complete, dominantie komt altijd tot uiting. Hier kan er bij het zien van het fenotype geen onderscheidt gemaakt worden tussen een homozygoot of een heterozygoot allel. Nulmutaties zijn volledig recessief. Vormen van dominantie variantie zijn:

• Haploinsufficiënt: een gen kan alleen functioneren als die de juist doseringen krijgt van een allel. Dit allel, kan bijvoorbeeld, een heterozygoot wild type allel zijn +m, maar heeft een homozygoot wild type allel ++ nodig om te kunnen functioneren.

• Dominant negatief: hierbij treden polipeptiden, met deze mutatie, als een slechterik op en verstoord de functie van het wilde type allel. Mutaties in genen die coderen voor eenheden als homo- of heterodimeren kunnen zich als een dominant negatief gedragen.

• Incomplete dominantie: hierbij kan een heterozygoot allel +r het dominante gen niet totaal tot uiting laten komen.

• Codominantie: twee typen allelen zijn dominant. Hierdoor komen ze ook samen tot uiting. Een goed voorbeeld hierbij is het menselijk bloed. Bloedgroep A en bloedgroep B zijn beide dominant, waardoor er ook bloedgroep AB ontstaat.

Dodelijke allelen zijn allelen combinaties die niet tot uiting komen, aangezien het organisme dan niet levensvatbaar is. Ook kunnen delen van een organisme niet ontwikkelen, zoals een nier, waardoor de functie begrepen kan worden van dat homozygote recessieve allel. Er zijn ook recessieve allelen die subdodelijk zijn. Deze laten een deel van de nakomelingen overleven, maar een deel zal helaas sterven. De sterfelijkheid varieert van 0 tot 100%. Diploïde, recessieve dodelijke allelen kunnen behouden worden als zygoten. Haploïde temperatuur dodelijke allelen zijn ook interessant. Deze mutaties behoren tot een klasse die tot uiting komen bij een bepaalde temperatuur. Het fenotypen van de wilde typen zit hierbij meestal op kamertemperatuur. Dit is de tolerante temperatuur. Maar bij een andere temperatuur kan ditzelfde allel een mutant allel zijn. Er wordt gedacht dat door temperatuurverandering een eiwit in een andere vorm buigt en dan ander ‘werk’ doet.

Allelen die meerdere eigenschappen van een organisme regelen, worden pleiotropische allelen genoemd.

6.2 Interactie van genenpaden

Genen werken door het controleren van celchemie. Door middel van metabolisme communiceren de genen met elkaar en beïnvloeden ze elkaars werking. Een belangrijke hypothese, die ondertussen vaak aangetoond is en als waar word aangenomen, is dat genen verantwoordelijk zijn voor de werking van enzymen, en elk gen blijkbaar een specifiek enzym bezit in een reeks onderling verbonden stappen in een biochemische route. De hypothese heeft de naam ‘one-gene-one-polypeptide hypothesis’ gekregen, aangezien alle eiwitten gemaakt worden vanuit geninformatie. De paar genen die voor RNA coderen worden niet in een eiwit vertaal, aangezien RNA van zichzelf een unieke functie heeft. Dit worden functionele RNA’s genoemd.

Chemische synthese in cellen wordt door middel van paden, met opvolgende stappen, gekatalyseerd door enzymen. De genen die voor een specifiek enzym coderen, in een specifiek pad, vormt een interactie voor een deel van het genoom.

Er zijn verschillende gen-interactie paden:

• Neurospora arginine pad: dit is een synthetisch pad dat door voor essentiële voeding zorgt door middel van enzymatische kettingen.

• Signaal-transductie pad: is een complex pad dat signalen uit de omgeving naar het genoom brengt en van het ene gen naar het andere gen. Deze paden zijn nodig voor de functie van een organisme.

6.3 Genen interacties onderbreken

Een manier om te kijken of genen interactie vertonen voor een bepaalde biologische eigenschap, zijn de volgende stappen te hanteren:

• Stap 1: Verkrijg zoveel mogelijk enkel-gen mutanten en kijk of deze dominant zijn.

• Stap 2: Kijk of deze mutanten allelisme vertonen. Allelisme is of de allelen op één of meerdere loci zitten.

• Stap 3: Voeg de mutanten samen in paren om zo dubbele mutanten te maken. Kijk vervolgens of deze mutanten interactie vertonen.

Als genen interactie vertonen, dan verschilt het fenotype van de simpele combinatie van beide enkel-gen mutant fenotypen. Als de mutanten van verschillende genen interactie vertonen, dan kan er afgeleid worden dat de wilde type genen ook normale interactie vertonen.

Om te kijken of mutaties op hetzelfde gen liggen, kan de locatie van beide opgezocht worden. Dit is alleen tijdveroverend en daarom kan de complementation test uitgevoerd worden. Bij diploïde genen wordt deze test uitgevoerd door het kruisen van twee homozygote recessieve mutaties. Vervolgens wordt er gekeken of de nakomelingen het wilde type gen hebben gekregen. Als dit zo is, dan moeten de mutanten op verschillende genen. Als de nakomelingen niet het wilde type gen hebben, dan moeten de recessieve mutaties van de allelen op hetzelfde gen zitten. Er is dan namelijk geen wilde type gen op een andere loci. Een uitgebreid voorbeeld hiervan is te vinden op bladzijde 211-213.

Deze complementation test kan niet uitgevoerd worden bij schimmels, omdat ze haploïde zijn. Hier wordt dus een andere manier gebruikt om de mutanten bij elkaar te brengen. Dit heet heterokaryon, want tijdens het fuseren van de celkernen blijven de kernen apart van elkaar. Dit is dan een soort diploïde verschijnsel.

Dus; wanneer twee onafhankelijk verkregen recessieve mutanten dezelfde recessieve fenotypen produceren, dan moeten de allelen op hetzelfde gen liggen.

Om te zien of twee genen interactie vertonen, moet het fenotype van de dubbele mutant gevonden worden om te zien of dit anders werkt dan enkele mutanten. Als de complementation test is uitgevoerd, en er verschillende genen zijn, dan wordt F1 onderling gekruist. Vervolgens bevat F2 de dubbele mutant. Hier horen ook de ratio’s van Mendel bij. De ratio 9:3:3:1 is het makkelijkst en daarbij is de ‘1’ de dubbele mutant. De ratio 9:7 zijn de 3:3:1 van de vorige ratio bij elkaar opgeteld. Hier zijn er maar twee fenotypen en is de interactie moeilijk te onderscheiden. Ook is er een 9:3:4 ratio en suggereert een interactie dat epistasis wordt genoemd. Dit houdt in dat een dubbele mutant een fenotype laat zien, maar niet die van de andere mutant. Dit komt doordat de ene mutant eerder aan de ‘beurt’ is om gekozen te worden voor het fenotype. Hier wordt de mutant gemaskeerd door de andere mutant. Als laatste is er nog een 12:3:1 ratio waarbij er ook epistasis is, de ‘12’, maar daar zit een dominant gen dat niet voorkomt in de 3:1.

6.4 Penetrantie en expressiviteit

Onderzoekers gebruiken graag duidelijke genotype met een bijbehorende fenotype en ratio. Hier wordt bij gezegd dat de genotype 100% penetrant zijn. Dit houdt in dat de mutanten 100% tot uiting komen. Maar vaak is dit niet het geval, waardoor een genotype niet altijd het bijbehorende fenotype laat zien. De mogelijke redenen dat een bepaald genotype niet te zien is in het fenotype, is als volgt:

• De omgeving beïnvloedt het fenotype.

• De beïnvloeding van andere inter-acterende genen.

• De subtiele effecten door een absentie van een gen kan moeilijk te meten zijn in een laboratorium.

De expressiviteit is ook een term om aan te duiden of een bepaald fenotype tot uiting komt.

7. Chromosomale veranderingen op grote schaal

Chromosomale veranderingen vinden niet op genen plaats, maar op chromosomaal gebied en hebben meer impact. Deze verandering vindt plaats door een breking ergens op het chromosoom. Dit kan vervolgens resulteren in verschillende soorten mutaties:

• Relocatie van genetisch materiaal. Dit kan op twee manieren plaatsvinden: 1) translocatie: er komt een stukje gen van een ander chromosoom, het stukje gen vervangen en 2) inversie: twee genetische stukjes wisselen van locatie.

• Verlies van genetisch materiaal. Dit kan ook op twee manieren plaatsvinden: 1) deletie: een stukje genetisch materiaal is verwijderd van het chromosoom en 2) in zijn geheel een chromosoom missen.

• Het verkrijgen van extra genetisch materiaal. Dit kan wederom op twee manieren plaatsvinden: 1) duplicatie: hierbij wordt een stukje gen verdubbeld en in het chromosoom opgenomen en 2) een extra chromosoom.

7.1 Veranderingen in chromosoomnummer

Organisme met meerdere delen van een chromosoom heet euploïde. Veranderingen in het totale chromosoom wordt aangeduid door afwijkende euploïde. Polyploïdes zijn individuele organismen die meer dan twee chromosomensets hebben. Deze kunnen 3n triploïde, 4n tetraploïde, 5n pentaploïde, 6n hexaploïde en ga zo maar verder zijn. Monoploïde (n) betekent iets anders dan haploïde zijn. Dit houdt in dat er een fout is opgetreden en er geen chromosoompaar is, maar een enkel chromosoom. Parthenogenesis is wanneer organismen zich ontwikkelen zonder dat er seksuele bevruchting voor nodig was.

Er is nog een tweedeling bij polyploïde chromosomen: 1) autopolyploïde en 2) allopolyploïde. Autopolyploïde geeft aan dat de meerdere chromosomensets van één soort komen. En allopolyploïde houdt in dat er twee of meer sets van een andere soort komen. Dit valt wel binnen gerelateerde soorten. Daarnaast zijn polyploïde organismen met een oneven aantal chromosomensets, zoals triploïde, vaak onvruchtbaar omdat hun gameten en nakomelingen aneuploïde zijn. Veranderingen in delen van het chromosoom wordt aangeduid door aneuploïde. Deze verschillen van het wilde type aangezien ze een ander aantal chromosoomnummer hebben. Voor autosomen zijn de aneuploïde 2n + 1 trisomisch, 2n01 is monosomisch en 2n-2 is het verlies van beide chromosomen. Bij haploïdes heb je nog n+1 is disomisch. De seksechromosomen kunnen voorkomen in de volgordes XXY, XYY, XXX en XO. De O geeft aan dat daar geen seksechromosoom is.

De oorzaak van aneuploïde is nondisjunctie. Hierbij faalt het proces waarbij de twee chromosomen niet goed scheiden van elkaar tijdens het segregatieproces in de meiose of mitose. Hierdoor bevat de ene cel twee chromosomen en de andere cel geen enkel chromosoom. Meiotische nondisjunctie komt het meeste voor. Nondisjunctie komt, netzoals een mutatie, spontaan voor. Cross overs zijn nodig om bivalenten gepaard te houden totdat de anafase plaatsvindt. Als de cross over faalt voor een bepaalde reden, dan vindt er eerste-scheiding nondisjunctie plaats.

Monosomische chromosomen missen een chromosoom, wat vaak door deletie komt. Bij mensen gaan de meeste organismen dood, maar een deel van X-chromosoom monosomische organismen overleeft. Dit resulteert in het Turner syndroom. Dit zijn vrouwen met een XO chromosoom en zijn onvruchtbaar, klein en nog meer (zie hiervoor plaatje 7-13 op bladzijde 247).

Trisomische chromosomen hebben een extra chromosoom en kunnen vruchtbaar zijn. Tijdens de anafase gaat een combinatie van twee chromosomen van de drie naar één pool en de overgebleven chromosoom wordt naar de andere pool getrokken. De combinatie XXY resulteert in het Klinefelter syndroom. Dit houdt in dat mannen vrouwelijke eigenschappen ontwikkelen, maar ze zijn wel vruchtbaar. De chromosomen XYY wordt nog onderzocht, maar het brengt waarschijnlijk geen extra agressie met zich mee en de meeste mannen zijn vruchtbaar. De chromosomen XXX zijn redelijk normale en vruchtbare vrouwen. Deze ziektes worden niet vaak doorgegeven aangezien een derde chromosoom niet altijd meepaart. Een ander voorbeeld van trisomie is het syndroom van Down. Voor de uitingen van het syndroom van Down zie figuur 7-16 op bladzijde 249. Verder sterven alle trisomie’s in de baarmoeder, behalve trisomie 13 (Patau syndroom en trisomie 18 (Edwards syndroom). Beide hebben zware fysieke en mentale retardatie. Ze sterven binnen 130 dagen en een week na de geboorte.

Planten zijn meer bestand tegen trisomie. Jimsonkruid is haploïde en als hier polyploïde plaatsvindt, is de knop twee keer zo groot. Aneuploïde hierbij brengt allemaal andere fenotypen met zich mee. Bij fruitvliegjes is er ook aneuploïde bij chromosoom 4. Als deze monosomisch zijn dan is het fruitvliegje zeer klein en als het fruitvliegje trisomie is op chromosoom 4 dan scheelt het niet veel van het normale fruitvliegje.

Aneuploïdes zijn anders dan polyploïdes qua fenotype aangezien er sprake is van genenbalans. Dit houdt in dat aneuploïdes nooit een gelijke balans hebben qua chromosomen omdat ze een deel missen of extra hebben. De relatie tussen het aantal kopieën van een gen en de hoeveelheid dat het gen produceert, heet het gen-dosering effect. Ook is er doseringscompensatie. Dit vindt bijvoorbeeld plaats bij de chromosoom XX-combinatie en de chromosoom XY-combinatie, aangezien een man maar één X heeft. Bij fruitvliegjes resulteert dit in een twee keer zo hard werken van het mannelijke X-chromosoom.

7.2 Veranderingen in de structuur van het chromosoom

Onder structuurveranderingen in het chromosoom vallen veranderingen inversie, translocatie, deletie of duplicatie. Hiervoor moet in alle gevallen het chromosoom op een bepaalde plaats brengen en aan een ander deel weer hechten. Een paar punten moeten in gedachten gehouden worden om te begrijpen hoe breking werkt:

• Elk chromosoom is een enkel dubbel-geregen DNA molecuul

• Een chromosomale verandering komt door twee of meer dubbel-geregen DNA brekingen.

• Dubbel-geregen brekingen zijn dodelijk, tenzij ze gemaakt worden.

• Het repareren van een gebroken DNA stuk wordt gedaan door twee gebroken DNA stukken aan het elkaar te maken.

• Er is verandering in het DNA als de gebroken stukken niet meer aan elkaar worden gemaakt.

• De enige chromosomale verandering dat meiose overleeft zijn diegene die een centromeer hebben en twee telomerasen. Als een verandering een chromosoom produceert dat een centromeer mist, acentrisch, zal het chromosoom niet goed naar de polen worden getrokken. Hierdoor worden acentrische chromosomen niet overgedragen. Bij een dicentrisch chromosoom wordt er goed gescheiden en ontstaat er een anafase brug. Maar er is geen telomeer waardoor er niet goed gekopieerd kan worden.

• Als een gen wordt toegevoegd of gedeletet, dan is de genenbalans niet in evenwicht.

Crossing over tussen herhalende DNA delen heet non-allelische homologe recombinantie (NAHR). Twee veranderingen hierbij zijn: 1) een ongebalanceerde verandering en 2) een gebalanceerde verandering. Een ongebalanceerde verandering zorgt voor een verandering in de gendoseringen (duplicatie of deletie). Een gebalanceerde verandering verandert de genvolgorde, maar brengt het evenwicht niet in de war (inversie of translocatie).

Deletie is het verlies van een (deel van een) chromosoom. Hiervoor moeten twee chromosomen hebben gebroken waarna het stuk ertussen in wegvalt. Het verwijderde fragment heeft geen centromeer en zal dus ook niet in de celdeling naar een pool getrokken worden en dus ook niet overleven. De effecten van deletie hangt af van de grote. Een kleine deletie in een gen, intragenetische deletie, inactiveert het gen en heeft hetzelfde effect als een nulmutatie. Multigenetische deleties zijn veel ingrijpender. Als een homozygoot een stuk verwijderd op allebei precies dezelfde plek, overleeft het niet. Als van een homoloog gedeelte er aan de ene kant een stukje wordt verwijderd, zal er waarschijnlijk een deletie loop ontstaan. Hierbij wordt het overgebleven homoloog gedeelte opgevouwen in een rondje, waarna het DNA rustig verder kan als de homoloog weer gelijk is (figuur 7-20 op bladzijde 255). Een andere manier om deletie te ontdekken is dat een recessief allel plotseling tot uiting komt. Dit wordt pseudodominantie genoemd, aangezien het lijkt alsof de recessieve allelen op dat moment dominant zijn. Hierdoor kunnen er weer recessieve allelen ontdekt wordt (deletie kaarten maken).

Een duplicatie kan aangrenzend zijn aan zijn dubbelganger (tandem duplicatie) of ergens anders op het genoom liggen (insertie duplicatie). Een diploïde cel bevat een duplicatie heeft drie kopieën van het allel. In de meiotische profase laten tandem duplicaties een loop zien bij het ongepaarde extra gebied.

Wederkerige translocatie houdt in dat een stukje DNA verwisselt wordt tussen genen waardoor beide stukken een nieuwe locatie krijgen. Genen kunnen op twee manieren scheiden. De eerste is aangrenzende-1 scheiding. Dit houdt in dat de genen die aan elkaar grenzen samen verder zullen gaan. Tegenovergestelde scheiding is precies het tegen overgestelde en houdt in dat de genen die tegenover elkaar liggen, en elkaar niet aanraken, verder met elkaar zullen gaan. Deze twee scheidingen komen in gelijke getalen voor, waardoor de helft van de gameten non-functioneel zullen zijn. Dit wordt aangeduidt met de term semi-vruchtbaar. Translocatie kan gezien worden als een soort crossing over, aangezien genen informatie uitwisselen. Toch is dit niet volledige crossing over, aangezien er anders sprake is van deletie en duplicatie. De genen passen namelijk niet allemaal op elkaar. Dit fenomeen wordt aangeduid met pseudolinkage.

Een Robertsoniaanse translocatie vindt plaats bij twee homologe (gepaarde) chromosomen of niet-homologe chromosomen (twee verschillende chromosomen). Een kenmerk van Robertsoniaanse translocaties is dat zij een acrocentrisch centromeer bevatten. Deze verdeelt het chromosoom in een grote arm met de meeste genen en een korte arm die een veel minder informatie bevat. Tijdens een Robertsoniaanse translocatie, de deelnemende chromosomen breken op hun centromeren en de lange armen smelten samen tot een enkel chromosoom met een enkel centromeer. De korte armen zijn dan apart en gaan gewoonlijk verloren binnen een enkele celdeling. Bij mensen, resulteert Robertsoniaanse translocatie in het sluiten van de lange arm van chromosoom 21 met de lange arm van chromosoom 14 (of 15). Hierdoor is de drager fenotypisch normaal, omdat er twee kopieën van alle belangrijke chromosoomarmen en dus twee kopieën van alle essentiële genen zijn. Echter, de nakomelingen van deze drager erven onevenwichtige trisomie 21, dat het syndroom van Down veroorzaakt.

Inversies en translocaties zijn handig om genenkaarten te maken. Ook worden ze gebruikt om specifieke deleties of duplicaties te maken. Daarnaast kunnen ze gebruikt worden om heterochromatine te bestuderen. Heterochromatine is de dichtheid van de chromosomen. Deze kan verschillen en zorgen voor bescherming van het DNA.

Veranderingen in het DNA kunnen kanker veroorzaken. Vaak zijn genen die de celdeling in controle houden, proto-oncogenen, verstoord. Dit kan op twee manieren: 1) het proto-oncogen is verplaatst naar een nieuwe locatie naast een nieuw regulerend element en 2) door translocatie wordt er een hybride gen gevormd door een deel van een proto-oncogen en een ander gen.

7.3 Spontaanheid van humane chromosoom mutaties

Er zijn nog twijfels over het aantal mutaties en chromosoom veranderingen er zijn. Er wordt wel geacht dat dit er veel zijn.

8. DNA: structuur en replicatie

Belangrijke punten over DNA zijn 1) de informatie voor het maken van een organisme ligt gecodeerd in de basenvolgorde die in een dubbele helix verwerkt zijn en 2) een enkele streng nodig is om DNA verder te maken, omdat de basenparen een vaste partner hebben, kan de template gebruikt worden voor nakomelingen.

8.1 DNA: het genetische materiaal

Voordat Watson en Crick de DNA structuur hadden ontdekt, waren er al enige observaties duidelijk:

1. Genen gaven informatie door aan nakomelingen en ook waren mutaties bekend. Alleen de fysieke structuur hiervan was nog niet bekend.

2. De one-gene-one-polypeptide hypothese was er.

3. Genen werden gedragen door chromosomen.

4. De chromosomen bevatten DNA en eiwitten.

5. DNA is genetisch materiaal

Door transformaties in genotypen veranderde het fenotype ook mee. Dit werd gevonden door Griffith door verschillende cellen in muizen te injecteren en vervolgens te kijken of ze dood gingen. Dit duidde eveneens op het feit dat genen, een erfelijk materiaal, gemaakt waren van DNA.

Vele onderzoekers in de jaren ’50 konden niet geloven dat zoiets simpels (DNA dat maar vier basen bevat) alle organismen op aarde kon verklaren. Het Hershey-Chase experiment liet zien dat het genetische materiaal van fagen DNA is, en niet een eiwit. In de ene set zit een eiwitlaag dat gelabeld is met radioactieve zwavel. Dit was niet gevonden in het DNA. In de andere set, het DNA is gelabeld met radioactieve fosformoleculen, maar dit was verder niet gevonden in aminozuren. Alleen de fosformoleculen zijn geïnjecteerd in de E. Coli waardoor er bewijs is voor de rol van DNA dat deze nieuwe fagen maakt.

8.2 De DNA structuur

Voordat de DNA-structuur bekend was, waren er wel al drie kenmerken van DNA waaraan het aan moest voldoen:

1. Aangezien in elke cel het DNA hetzelfde is, moet de celdeling ook zorgen voor een trouwe overerving van datzelfde DNA.

2. Het DNA moet de erfelijke informatie bevatten.

3. Het DNA kan veranderen door bepaalde gebeurtenissen. Dit was al duidelijk door de kennis over mutaties.

Er waren een aantal bouwblokken om de helix-structuur van het DNA te begrijpen. Deze bouwblokken worden nucleotides genoemd en bestaan uit fosfaat, suikergroep en een base (A, T, G of C). De twee basen adenine en guanine hebben twee ringen in een molecuulbouw waardoor deze purines worden genoemd. De basen cytosine en thymine hebben maar één ring en worden pyrimidine genoemd.

Chargaff heeft ook een aantal regels opgesteld over het DNA. 1) de totale hoeveelheid pyrimidine (T en C) is evenveel als de hoeveelheid pyrine (A en G). 2) De hoeveelheden A en T zijn gelijk en de hoeveelheden G en C zijn gelijk. Maar de hoeveelheid A+T en G+C hoeft niet per se gelijk te zijn.

Door het gebruik van X-ray heeft Rosalind Franklin gezien dat het DNA in een soort kruis ligt. En daarom heen een soort ronde hoes. Een mooie plaatje hiervan is te zien op bladzijde 286. Dit was uiteindelijk het cruciale puzzelstukje voor de ontdekking van de dubbele helix.

De dubbele helix is dus de vorm waarin het DNA zich bevindt. Daarnaast loopt het compartiment dat bestaat uit een fosfaat- en een suikergroep van 3’ naar 5’. Per stukje DNA, AT of GC, loopt dit opnieuw van 5’ naar 3’. De twee strengen DNA liggen tegenover elkaar (antiparallel). Elke base zit vast aan de 1’ koolstof-atoom van een suikergroep in de streng. Precies twee basen, pyrimidine en pyrine, passen in de diameter van de helix. Daarbij zijn G-C verbindingen sterker dan A-T verbindingen. Dit aangetoond door DNA te verhitten. G-C verbindingen hebben daarbij een hogere temperatuur nodig.

De dubbele helix toonde uiteindelijk drie belangrijke factoren voor genetische overdracht. Het eerste punt was dat de volgorde, de genetische code, van basen een bepaald aminozuur vormde wat weer een eiwit aanmaakt. Het tweede punt was dat een mutatie deze eiwitten zou kunnen beïnvloeden. Het laatste en derde punt is dat de vaste combinaties van basen zorgden voor de mogelijkheid voor het kopiëren van DNA door maar één streng te hebben.

8.3 Semiconservatieve replicatie

De dubbele helix gaat bij het repliceren van het DNA open als een rits. De enkele helixen nu worden gezien als een soort mal. Vrije basen paren met de bijbehorende basen aan de enkele helix streng. De twee dochter DNA cellen bevatten nu dus één streng van het nieuwe DNA en de andere streng bevat het DNA van het originele DNA. Dit is semiconservatieve replicatie. Bij conservatieve replicatie blijven de ouderlijke DNA strengen bij elkaar en de nieuwe DNA strengen bij elkaar. Bij uiteenjagende replicatie bevat elke streng ouderlijk- en nieuw DNA.

De volgende stap was dus om te kijken hoe het nieuwe DNA verdeeld was (semiconservatief, conservatief of uiteenjagend). In het experiment van Meselson-Stahl werd aangetoond dat het semiconservatief was. Dit is duidelijk in kaart gebracht in figuur 8-13 op bladzijde 291.

Samen met radioactieve markers, heeft Cairns aangetoond dat er op een stukje molecuul een specifieke formule is waar het DNA opengaat en vervolgens kan beginnen met kopiëren.

Polymeren katalyseren de ketting verlenging door middel van drie fosfaatgroepen op te offeren. Deze zorgen namelijk voor de energie. Het gedeelte polymerase is ook een stukje DNA en heeft de volgende drie taken.

1. De ketting groei van de helix katalyseren in de 5’-3’-richting.

2. Een 3’-5’ exonuclease activiteit dat foutgeplaatste basen verwijdert.

3. Een 5’-3’- exonuclease activiteit dat enkele strengen DNA of RNA afbreekt.

8.4 Overzicht van DNA replicatie

De replicatie vork is het gedeelte waar de twee DNA strengen uit elkaar gaan. Aan de ene kant kan het losse DNA makkelijk aan de template plakken in de 5’-3’ richting. De nieuwe streng heet de ‘leading strand’. Aan de andere kant ligt de template in de 3’-5’ richting. Dit is de ‘verkeerde kant’. Hierdoor worden er telkens korte segmenten gemaakt, in de 5’-3’ richting, waarna deze segmenten aan elkaar worden geplakt. Deze stukjes heten Okazaki fragmenten. Een ander probleem is dat de polymerase de ketting kan verlengen, maar kan dit proces niet starten. Hier is een primer voor nodig en dit gebeurt bij elk Okazaki fragment. Deze primers bestaan uit een set eiwitten, een primosoom, waarvan een centraal deel een primase (type RNA polimerase) bevat. Pol 1 verwijdert dit weer. DNA ligase zorgt ervoor dat deze twee fragmenten dan aan elkaar komen. Het fragment dat de verkeerde richting op wordt gemaakt, wordt de ‘lagging strand’ genoemd.
Tautomerisatie is wanneer een base niet aan de goede base zit. Hierbij kunnen er fouten zitten in de chemische binding tussen de twee basen op imino- of enolniveau. Dit wordt gelukkig vaak opgevangen door de exonuclease activiteit en verbetert.

8.5 Replisoom: een opvallend replicerende machine

Het DNA wordt met gigantische snelheid gekopieerd. De basenparen worden met een snelheid van 2000 nucleotides per seconde gekopieerd. Door een super mechanisme gaat de snelheid niet ten koste van de precisie. Belangrijke onderdelen van dit mechanisme zijn het pol 3 holo-enzym en de β klem. Het pol 3 holo-enzym bevat twee katalytische kernen en vele ‘accessory’ eiwitten. De twee katalytische kernen zorgen voor de aanmaak van de leading en lagging strengen. De ‘accessory’ eiwitten maken een brug tussen de twee katalytische kernen om zo te communiceren en gelijk te werken. De β klem zorgt ervoor dat de pol 3 aan het DNA blijft zitten. Eerst was dit een verdelend enzym dat losliet na een paar basen en nu is dit een processief enzym dat duizenden basen vastmaakt.
Een genoom van een bacterie is rond. Hierdoor begint het ontrollen van het DNA hier op het originele punt (oriC) waarna het ontrollen en kopiëren beide kanten opgaat.

Het ontrollen van het DNA raakt niet in de knoop door helicasen en topo-isomerasen. De helicasen zorgen ervoor dat het DNA ontrolt. Het single-strand-binding (SSB) eiwit zorgt ervoor dat het DNA niet direct weer aan elkaar plakt.

8.6 Replicatie in eukaryotische organismen

Eukaryotische organismen hebben ook een replisoom, alleen zijn deze iets ingewikkelder. Bij eukaryoten moeten de histonen ook nog verwerkt worden om het DNA te kunnen ontrollen. Chromatines zijn compact opgerolde histonen, waar weer DNA om heen gewikkeld zit. Een histon en DNA samen heet een nucleosoom. Bij het ontrollen van het DNA pakt de CAF-1 de histonen aan. Een soort β klem bij eukaryoten wordt de ‘proliferating cell nuclear antigen (PCNA)’ genoemd.
Replicatie bij lineaire eukaryoten gebeurt niet op een enkele origineel punt, maar wel op duizenden plekken om zo al DNA op tijd af te krijgen. Net zoals het originele aanknopingspunt bij prokaryoten, bevat gist ook zo’n origineel aanknopingspunt. Op dat punt wordt de DNA volgorde herkent door de ‘origin recognition complex’ (ORC) en andere eiwitten om het replisoom te activeren. Aangezien eukaryoten zo complex zijn en niet een gereserveerd stukje DNA hebben, is er voor eukaryoten minder informatie over de originele aanknopingspunten.

8.7 Telomeren en telomerase: replicatie einde

Het laatste eind van de strengen, telomeren, zijn moeilijk te kopiëren. Elke keer dat DNA-replicatie plaatsvindt voor de celdeling, worden de nieuwe chromosomen een stukje korter. Dit komt doordat DNA-polymerase alleen nucleotiden aan de 3’-kant van een DNA molecuul kan aanbouwen. Na afloop van de DNA-replicatie verdwijnen de primers waarmee de replicatie begon. Er blijft dan aan een van de strengen een stukje DNA over waar geen kopie van gemaakt kan worden, doordat daar geen nieuwe nucleotiden meer kunnen worden aangezet. De nieuwe gemaakte streng is daarom korter dan de streng die gekopieerd is. De telomerase zorgt ervoor dat die laatste drie nucleotiden nog ingevuld kunnen worden. Dit wordt in kaart gebracht door figuur 8-28 op bladzijde 304. Alleen de telomerasen houden ook op een gegeven moment op. Dit heeft waarschijnlijk te maken met ouder worden, aangezien er dan meer telomerasen nodig zijn geweest.

Er zijn aandoeningen waarbij personen met korte telomerase kettingen worden geboren. Deze mensen hebben een mutatie in het WRN gen dat codeert voor het helicase eiwit.

9. RNA: transcriptie en verwerken

De mens heeft in totaal zo’n 26.000 genen. Dit is verbijsterend laag in vergelijking met simpele organismen.
De genen van eukaryoten bevatten exonen (expressieve genen) en intronen, die als pauzes fungeren tussen de exonen. RNA neemt deze beide over, maar een machine, spliceosome genoemd, verwijdert de intronen en verbindt de exonen samen. Dit gebeurt tijdens het RNA splicing proces. Door middel van het proces alternatief splicing, zijn er 20.000 genen die voor zo’n 100.000 eiwitten coderen. Een ander verassend aspect is dat er maar twee procent van de genen codeert voor complexe eiwitten. RNA wordt wel meer gebruikt en zal verder in dit hoofdstuk behandeld worden. Het meeste van het genoom codeert voor RNA (niet-eiwit producerende RNA).
RNA wordt gebruikt om de DNA code over te nemen (transcriptie). Vervolgens wordt dit vertaald (translatie), maar dit komt in hoofdstuk 10 verder aan bod. De veranderingen die RNA ondergaat ten opzichte van DNA, is dat RNA de base U bevat in plaats van de base T. Ook worden de introns verwijderd. De niet-eiwit producerende RNA’s worden niet vertaald, maar hebben wel een belangrijke rol.

De transacties van DNA en RNA vinden plaats door het matchen van bijbehorende basen en de binding van verschillende eiwitten op specifieke plekken op het DNA en RNA.

9.1 RNA

Aangezien DNA in de celkern zit en de translatie in het cytoplasma plaats vindt, moest er wel een tussenpersoon zijn. Dit is onderzocht, aangezien men wist dat er uracil zou zijn in plaats van de T-base, door middel van het voed-volg experiment. Hierbij worden gelabelde uracil basen geïnjecteerd. Vervolgens wordt er gekeken waar deze basen zich bevinden om te kijken hoe het RNA zich verplaatst. Dit gaat dus vanaf de kern naar het cytoplasma. Een aantal belangrijke verschillen tussen RNA en DNA zijn:

• RNA is een enkele streng in plaats van een dubbele helix. Deze enkele streng is flexibel en kan ook mogelijk basen onderling combineren (intramoleculair base paring). Dit bepaalt een groot deel van de volgorde van het RNA.

• RNA heeft een ribose suiker groep in plaats van een deoxyribose suikergroep, zoals bij DNA, aangezien RNA een OH-groep mist.

• De base thymine wordt vervangen door de base uracil. De G-base kan binden met uracil, maar dit gebeurt alleen tijdens het rondzweven van het RNA en niet tijdens de transcriptie. Ook is deze binding veel minder sterk dan de G-C binding.

• RNA kan net zoals een eiwit voor katalysatie zorgen. Dit kan DNA niet.

Er zijn twee soorten RNA, waarvan er weer sub-RNA-categorieën zijn:

• Messenger RNA (mRNA) zorgt voor het vertalen van DNA naar eiwit.

• Functionele RNA zorgt ervoor dat er uiteindelijk RNA vertaalt kan worden.

  • Transfer RNA (tRNA) zorgen voor het brengen van de juiste moleculen naar het mRNA.

  • Ribosomaal RNA (rRNA) stelt de aminozuur ketting van het mRNA en het tRNA samen.

  • Speciaal voor eukaryoten is de small nuclear RNA (snRNA). Deze zorgen ook voor de transcriptie in de celkern. Ook kunnen ze helpen bij de spliceosomen.

  • MicroRNA (miRNA) zorgen voor de juiste hoeveelheid eiwit dat wordt geproduceerd. Dit is suppressor DNA.

  • Small interfering RNA (siRNA) en piwi-interacting RNA (piRNA) houden het verspreiden van wegwerpelementen naar andere loci tegen. siRNA doet dit bij planten en piRNA doet dit bij dieren. Daarnaast helpt siRNA tegen de productie van virussen. Deze genen zorgen dus voor het behoud van het genoom.

  • Long noncoding RNA (lncRNA) wordt geacht een rol te spelen bij het mechanisme gendosering, maar verder is hier nog niks bekend over.

Aangezien het RNA altijd nodig is, en ook elke soort, wordt de transcriptie ook wel eens ‘oprichtend’ genoemd.

9.2 Transcriptie

Het RNA is het transcript, de kopie, van het DNA. Daarbij wordt één streng van het DNA gebruikt. De streng van het DNA ligt in de 3’-5’ richting, waardoor het RNA in de 5’-3’ richting kan overschrijven. Het RNA polymerase zorgt voor het kopiëren van de juiste base. De template streng wordt overgenomen, waardoor de andere streng, de nontemplate, bijna hetzelfde is als de gekopieerde DNA streng. Alleen is T hier in U verandert.

Het RNA weet waar die moet beginnen en stoppen met kopiëren op het oneindige gen, vanwege de inwijding, verlenging en begrenzing. Prokaryoten en eukaryoten verschillen hier in op een paar vlakken. Als eerst zullen de drie fasen van prokaryoten besproken worden.

De RNA polymerase bindt aan een DNA volgorde, de premotor, dat het begin aangeeft. De richting van het kopiëren in de 3’- richting wordt downstream genoemd en de richting van het kopiëren in de 5’-richting wordt upstream genoemd. Als een stukje DNA meerdere ‘soorten’ woorden bevat, dan wordt de code genomen die het meeste voorkomt. Dit wordt consensus sequence genoemd. Een gedeelte dat niet gekopieerd wordt, omdat de inwijding een stukje upstream al plaats had gemaakt, wordt 5’ untranslated region (5’ URT) genoemd. RNA ploymerase holo-enzym bevat twee subunits van α, één van β, één van β’ en een ω. Ook bevat dit enzym de extra σ-factor. Als de premotor gevonden is laat deze σ-factor los en zal de transcriptie beginnen.

Tijdens de verlenging wordt het DNA in een transcriptie bel gehouden. Hier wordt de ene streng van de andere gescheiden waarbij één streng overgeschreven kan worden.

De begrenzing van kopieren kan door een aantal mechanismen gedaan worden. De transcriptie van een individueel gen continueert tot over het eiwitcoderende gedeelte van het gen. Hierdoor wordt er een 3’ untranslated region (3’ URT) gevormd. De eerste methode is, is om aan het einde van de strengen vele G’s of U’s aan elkaar te hebben. Deze enkele strengen stoppen dan vaak met kopiëren en kunnen dan een loop vormen (figuur 9-10 op bladzijde 320). Een andere transcriptie begrenzing is de rho-factor. De rho factor bindt aan de transcriptieterminator pauzeplaats, een blootgesteld gebied van enkelstrengs RNA (een stuk van 72 nucleotiden) met GC-rijke sequenties. Een uitgebreid regio, rijk aan cytosine en arm in guanine, wordt de rho utilization site genoemd.

9.3 Transcriptie bij eukaryoten

Eukaryoten hebben ook de begrippen inwijding, verlenging en begrenzing. Alleen hier is het iets complexer, aangezien eukaryoten simpelweg meer DNA hebben. Eukaryoten verschillen ten opzichte van prokaryoten in drie grote opzichten:

1. Eukaryoten hebben meer genen om gedecodeerd te worden en de dichtheid is dunner (de genen liggen verder uit elkaar dan bij prokaryoten). Hierdoor kan het begin van de transcriptie moeilijk gevonden worden. Daarom is deze taak verdeeld onder drie polymerases:

   • RNA polymerase 1 voor het overschrijven van rRNA genen.

   • RNA polymerase 2 schrijft alle eiwit coderende genen (sommige snRNA’s) over voor de mRNA. Voordat een premotor gevonden kan worden, moeten ‘general transcription factors’ binden, zodat RNA polymerase 2 ook kan binden.

   • RNA polymerase 3 schrijft de kleine eiwit coderende genen over (tRNA, snRNA en rRNA).

2. Bij prokaryoten kan het RNA bijna direct in een eiwit gecodeerd worden. Bij eukaryoten moet dat eerst nog uit de kern worden gehaald waarbij RNA processen nodig zijn. Hierbij wordt primair transcriptie of pre-RNA verandert in mRNA.

3. Eukaryoten bevatten chromatines en slaan het DNA heel compact op. Dit vergt een complex mechanisme om hier mogelijk bij te komen. Dit wordt verder behandeld in hoofdstuk 13.

De transcriptie bij eukaryoten begint met de GTF’s in combinatie met de RNA polymerase 2. Samen heet dit de ‘preinitation complex’ (PIC). Vervolgens vindt dit de TATAbox: de begin sequentie TATTAA. Hier bindt het PIC aan waardoor dit het eerste event is van de binding. Dit wordt de ‘TATA-binding protein’ (TBP) genoemd. Om verlenging te kunnen beginnen, het tweede proces in de transcriptie, moeten de GTF’s weg van de RNA polymerase 2. Dit is nog niet precies bekend, maar de ‘carboxyl tail domain’ (CTD) speelt hier een rol bij. Dit is de staart van het RNA en deze wordt gefosforceerd door de GTF’s.

De verlenging vindt plaats in de transcriptie bel waarbij eerst nog drie stappen moeten worden ondergaan: 1) de toevoeging van een cap tegen het afbreken van basen tijdens de reis en voor de translatie, 2) intronen weghalen door middel van alternatief splicen (door verschillende splicingen van het pre-mRNA worden er verschillende mRNA’s gevormd waardoor de eiwitten ook verschillen) en 3) de toevoeging van een 3’ staart van adenine nucleotiden (AAUAAA of AUUAAA). Eerst werd er gedacht dat het verwerken van het DNA post-transcriptie RNA gaf. Nu is er bekend dat dit verwerken tijdens de RNA aanmaak gebeurt (cotranscript).
Het proteoom is de totale eenheid van werkende eiwitten van een organisme.

9.4 Intron verwijdering en exon splicing

Het verwijderen van de introns en het aan elkaar plakken van de exonen, moet op een hele specifieke manier gebeuren. Dit gebeurt onder andere door de GU-AG-regel. Elk intron wordt aan elk uiteinde geknipt. Deze introns eindigen aan de 5’ kant vaak met GU en aan de andere 3’ kant vaak met AG. Daarnaast zijn snRNA’s betrokken bij het splicen van exonen. De snRNP’s zorgen voor de splitsingsplaatsen aan weerszijden van het intron. Dit gebeurt door het vormen van waterstofverbindingen aan de intron en exon uiteindes. Vervolgens roepen de snRNP’s meerdere delen om zo het spliceosoom te vormen. Deze verwijdert het intron door twee stappen: 1) het ene einde van het intron bindt zich met de interne adenine, waardoor een lasso wordt gevormd (een soort loop) en 2) de lasso wordt verwijderd, wat de intron bevat, waardoor de twee exonen aan elkaar gemaakt kunnen worden.

Self-splicing intronen verwijderen zichzelf doordat het zichzelf katalyseert en verwijdert. De RNA wereld is een theorie die inhoudt dat er RNA bestond voor DNA en als DNA fungeerde, aangezien RNA de genetische informatie kan encoderen en de biologische reacties kan katalyseren.

9.5 Kleine functionele RNA’s die het eukaryotische genoom reguleren en beschermen

Met kleine functionele RNA’s wordt dit keer geen snRNA of tRNA bedoeld, maar een ander type RNA dat ervoor zorgt dat fouten in het DNA verwijderd worden waardoor het genoom bewaart blijft. Deze micro RNA’s (miRNA’s) worden gemaakt uit langere RNA polymerase 2 transcripten door Dicer. Deze Dicer bindt aan de miRNA dat uit twee dubbele strengen bestaat (‘double stranded RNA; dsRNA). Een enkele streng van het miRNA bindt hierna aan het ‘RNA induced silencing complex (RISC) en verplaatst zich vervolgens naar de bijbehorende sequenties van het eiwit-coderende mRNA. RISC zorgt hierbij voor het onderdrukken van het vertalen of voor het promoten van mRNA afbraak.

Een tweede type RNA, siRNA, wordt gemaakt door een cel waarna het die cel onderdrukt. Gene silencing wordt gebruikt om genen te laten stoppen coderen voor een eiwit. Het dsRNA was nagemaakt en was samengesteld uit een coderend RNA streng en een bijbehorend, niet coderende streng. Een transgen is een getransformeerd gen dat bij een (ander) organisme wordt ingebracht. Dit wordt een transgeen organisme of een ‘genetically modified organism’ (GMO) genoemd. Wanneer beide transgenen worden onderdrukt, dan heet dit co-onderdrukking. RNA’s die onderdrukt worden of afgebroken worden door transgenen of geïnjecteerde dsRNA’s worden ‘small interfering’ RNA’s (siRNA’s) genoemd. Het fenomeen dat resulteert in het stilleggen van genen en virale resistentie door de productie van siRNA’s, wordt RNA ‘interference’ (RNAi) genoemd.

Niet coderend RNA wordt vaak gevormd in reactie op de injectie van vreemd DNA in het genoom. Dicer detecteert dsRNA dat zich vormt tussen de niet-coderende en het wel-coderende RNA. Dit wordt verder gevormd in kleine functionele RNA’s. RISC bindt aan een klein functioneel RNA en ontrolt dit om siRNA te vormen. Het siRNA geeft RISC een zetje in de richting naar een perfect complementair mRNA. Deze is afgebroken waardoor de expressie van het voormalige DNA wordt stilgelegd.

10. Eiwitten en hun synthese

De ziektes die voor de tijd van antibioticum rond gingen door de samenleving, werden getemperd door peniciline. Helaas zijn er in de tussentijd bacteriën die resistent voor antibiotica zijn geworden. Het is nu van belang dat wetenschappers deze mechanismen voor resistentie gaan begrijpen. Hierdoor kunnen ze mogelijk nieuwe antibiotica, of andere mechanismen, maken die deze bacteriën toch kunnen doden.
Er is al een methode om dit gedeeltelijk op te lossen. Door X-ray kristallografie hebben de wetenschappers een medicijn uitgevonden dat op de ribosomen van de prokaryoten inslaat. En deze is zo specifiek dat deze de ribosomen van de eukaryoten in tact laat.

Dit hoofdstuk zal gaan over de vertaling van RNA naar eiwitten. We hebben al gezien dat RNA te classificeren is in twee groepen: functionele en messenger RNA. De functionele RNA was weer te verdelen in tRNA (vertaalt de codon in een aminozuur en brengt dit naar de ribosomen) en rRNA (vertalen van aminozuren in eiwitten).Deze twee functionele RNA’s worden niet vertaald in eiwitten, zijn sterker dan mRNA en de transcriptie van rRNA en tRNA genen nemen de helft van het totaal aantal kern transcripties in.

10.1 Eiwit structuur

Een eiwit bestaat uit allemaal aminozuren. Aminozuren hebben allemaal dezelfde formule met een H₂N, H en COOH aan een C-atoom. Daarnaast is er een R-groep dat allerlei bindingen aan kan nemen en het eiwit zijn uniekheid geeft. Er zijn in totaal twintig aminozuren bekend. Een peptide band wordt gevormd door de covalentie. Hierbij is dat dus tussen het amino-einde en de zuurgroep. Daarnaast kunnen eiwitten vier structuren aannemen: 1) de primaire structuur is de makkelijkste structuur en is simpelweg plat, 2) de secundaire structuur wordt veroorzaakt door bindingen tussen moleculen, zoals een waterstofbinding, 3) de tertiaire structuur wordt gevormd door het opvouwen van een secundaire structuur en 4) de quartaire structuur wordt gevormd door twee of meerdere opgevouwen polypeptides (subunits) door zwakkere verbindingen. Bolvormige eiwitten zijn compacte structuren. Vezelige eiwitten zijn lineaire eiwitten en deze zijn belangrijk voor haar, huid en pezen. Ook zijn er actieve plaatsen, in combinatie met een specifieke R-groep, waar een substraat kan binden voor de specifieke functie. Deze specifieke functie wordt het domein van het eiwit genoemd.

10.2 De genetische code

Een codon is een woord uit de letters van het DNA voor een bepaald eiwit. Wanneer een codon overlapping laat zien, worden er voor verschillende eiwitten meerdere codons gebruikt. Deze codons sturen naar ‘meerdere’ eiwitten hun letters en vindt er dus overlapping plaats. Als er geen overlapping plaatsvindt, dan is er een drie letter code voor één eiwit.
Zoals eerder genoemd, zijn er twintig eiwitten bekend. Maar in het DNA zijn er maar vier verschillende letters. Deze kunnen niet apart een eiwit vormen, waardoor er meerdere letters gebruikt worden om een aminozuur te maken. Hier worden drie letters voorgebruikt, want twee letters brengt een totale mogelijkheid van 4 x 4 = 16 mee. Daarnaast hebben Crick, Brenner en medewerkers een onderzoek hiernaar gedaan. De conclusie hieruit is dat drie toevoegingen of drie verwijderingen van letters samenwerken om het wilde type fenotype terug te brengen, vanaf een mutatie. Aangezien er maar twintig eiwitten bekend zijn, blijven er 44 over die niks doen. Crick stelde de hypothese op dat die overige codes voor dezelfde aminozuren konden coderen. Dit is later door de biochemie aangetoond.

Uit het bovenstaande kunnen we de volgende punten vaststellen:

• De lineair sequentie van nucleotides, A, T, G en C, in een gen bepalen de lineaire sequentie in de aminozuren van het eiwit.

• De genetische code lapt niet over.

• Drie basen coderen een aminozuur. Deze triplets heten codon’s.

• De code wordt gelezen vanaf een vast begin punt en gaat verder tot het einde van de coderende volgorde. De code wordt opeenvolgend gelezen, omdat een enkele verandering ergens, zoals een mutatie, de codon’s uit balans brengt en de rest van de volgorde niet meer codeert waarvoor het in eerste instantie had moeten coderen.

• De code is gedegenereerd, aangezien meerdere codon’s coderen voor één aminozuur.

De codering van de letters werd ontdekt door Nirenberg en Matthaei. Zij hebben gekeken wat de codon’s UUU voor eiwit gaven. Hieruit kwam het eiwit fenylalaline. Vervolgens zijn er nog veel meer onderzoeken geweest om te kijken wat er uit de andere coderingen kwam.
Daarnaast zijn er codons die niet voor een aminozuur coderen, maar coderen als stopcodon. Deze codon’s zijn ervoor om de translatie te beëindigen en aan te geven dat de aminozuur klaar is. Er zijn in totaal drie stop codons: UAA (ochre), UGA (opal) en UAG (amber). Er kunnen ook mutaties in deze codons zitten en dan worden het ochre-, opal- of ambermutaties genoemd.

10.3 tRNA: de adapter

De adapter hypothese stelt dat elk aminozuur eerst wordt gehecht aan zijn eigen specifieke "adapter" waarna het verwerkt kan worden. Deze adapters zijn uiteindelijk de tRNA. Elk aminozuur hecht zich aan een specifieke tRNA, deze brengt het aminozuur naar de ribosoom dat het zal vertalen in een eiwit.

De structuur van een tRNA bestaat uit een klaver-vorm. Er zijn drie loops waarvan eentje de anticodon voor een bepaalde aminozuur bevat. Er is nog een andere opening waar een aminozuur aan kan hechten. De aminozuur bindt zich vast aan het tRNA door het enzym aminoacyl-tRNA synthetases. Voor elk aminozuur is een eigen aminoacyl-tRNA synthetase. Hierdoor heeft dit enzym twee plaatsen om vast te binden: eentje voor aan het aminozuur en eentje voor aan het tRNA. Als er een aminozuur aan het tRNA vastzit, is deze ‘geladen’. Doordat de tRNA altijd een beetje opgevouwen is, lijkt de structuur meer op de letter ‘L’ dan een klaverblad.

De genetische code is degenererend, aangezien in vele gevallen meer dan één codon aan een aminozuur wordt gekoppeld. Daarbij, meerdere codon’s kunnen paren met meer dan één anticodon. Dit wordt ook wel eens een wobbel genoemd: het paren van basen met een andere, nieuwe base.

10.4 Ribosomen

Een ribosoom maakt eiwitten door middel van tRNA en mRNA. Het is gemaakt uit rRNA en bevat een groot en een klein onderdeel. De ribosomen van eukaryoten (80S met 60S en 40S) en prokaryoten (70S met 50S en 30S) lijken erg veel op elkaar. Dit is een aanwijzing dat dit al een zeer oud proces is en bij onze voorouders op celniveau al voor kwam. De S geeft het aantal Svedberg units aan. Dit is een indicatie voor de moleculaire grootte.

Het ribosoom brengt de twee belangrijke spelers, tRNA en mRNA, samen. Deze twee spelers worden zo in het ribsoom geplaatst zodat het codon van de mRNA kan communiceren met het anticodon op het tRNA. De bindingplaatsen voor het mRNA zitten allemaal in de kleine subunit (30S of 40S). De drie bindingplaatsen, A, P en E, zitten op de grens van de twee subunits. De A-plaats bindt een binnenkomend aminoacyl-tRNA waarvan het anticodon matcht met de codon op de A-plaats van de 30S subunit. Als we verder gaan met de 5’-richting, is de volgens plaats de P-plaats. Deze bindt met de groeiende peptide ketting en stopt deze in een lange buis. De E-plaats, voor exit, laat het tRNA dat geen aminozuur meer bevat, gaan. Er zijn nog twee belangrijke kenmerken van een ribosoom. De eerste is het decodeer centrum in de 30S subunit. Deze is voor het verzekeren van een juist tRNA zich bindt aan de A-plaats. De peptidyltransferase centrum is in de 50S subunit. Hier wordt de peptide-binding gekatalyseerd.

De vertaling van de mRNA en de tRNA begint ook met de inwijding, vervolgt met de verlenging en eindigt met de begrenzing. De vertaling verschilt bij pro- en eukaryoten, waardoor ze apart worden besproken per onderdeel. Sommige delen zijn wel hetzelfde en worden voor beide samen besproken.

Inwijding. Bij de inwijding moeten beide karyoten ergens beginnen. Deze begint bij de ‘initiatiefnemer’ en vindt de codon AUG. De initiatiefnemer weet de AUG te vinden door de 5’ UTR. Dit was het laatste stukje mRNA dat niet verdubbeld was en een stukje ‘leeg DNA’ over had. Bij prokaryoten is dit stukje 5’ UTR cruciaal. Hier ligt een Shine-Dalgarno sequentie voor. Deze paart met het 3’ einde van een stukje rRNA (16S rRNA). Drie eiwitten zijn daarnaast van belang voor de inwijding. Deze zijn de IF1 en de IF2 (initiation factor) voor het verzekeren dan de initiatiefnemer van het tRNA aan de P-site bindt. De IF3 zorgt voor het bij elkaar houden van de 50S en 30S subunits. Doordat bij prokaryoten het DNA niet in een kern zit en nog vervoerd moeten worden, kan de translatie al beginnen tijdens het overschrijven.
Bij eukaryoten wordt het kapje aan het 5’ eind gebruikt om de AUG te vinden. Vervolgens kan het vertalen beginnen. Bekijk figuren 10-14 en 10-15 voor extra duidelijkheid.
Verlenging. Dit principe gaat hetzelfde bij prokaryoten en eukaryoten. De twee eiwitten Tu en G helpen met de verlenging. Een ternair complex van een aminoacyl-tRNA hecht aan een Tu factor, dat zich weer bindt aan de A-plaats. Als het aminozuur is toegevoegd, de groeiende polypeptide keten, G factor bindt aan de A plaats, terwijl de tRNA’s de anderen en hun mRNA codons in de E en P sites plaatsen. Het aminozuur wordt telkens aan elkaar gevoegd. Zie hiervoor figuur 10-16.
Begrenzing. De verlenging duurt voort totdat op de A-plaats een van de stopcodons komt. De tRNA herkent deze codons niet, maar de release factoren (RF1, RF2 en RF3) wel.

10.5 Het proteoom

Het proteoom is het totaal aantal eiwitten dat een organisme produceert. Dit proteoom wordt verijkt door twee cellulaire processen: het alternatieve splicen van pre-mRNA en de posttranslationele modificatie van eiwitten. Alternatief splicen zorgt ervoor dat één gen voor meer dan eiwit codeert. Eiwitten zijn gemaakt van functionele domeinen die gecodeerd worden door meerdere exonen. Dus, het alternatieve splicen van een pre-mRNA kan ervoor zorgen dat de aanmaak van meerdere eiwitten (isoforms) met verschillende combinaties van functionele domeinen. Een voorbeeld hiervan is te zien van het FGFR2 eiwit op figuur 10-19 op bladzijde 358.
Sommige eiwitten functioneren helemaal niet na gemaakt te zijn in een ribosoom. Hiervoor zijn soms nog posttranslationele events voor nodig. Een vorm van zo’n event is het eiwitvouwen. Een eiwit wordt dan in zijn goede drie-dimensionele vorm gevouwen zodat het wel kan functioneren. Een ander event is het bewerken van de aminozuren. Een eiwit bestaat uit een heleboel aminozuren en daar kunnen meer dan 300 bewerkingen mee gedaan worden. Twee daarvan worden besproken in het boek: 1) fosforlisering en 2) ubiquitinylatie. Bij fosforlisering worden er fosfaatgroepen aan de aminozuren serine, threonine en tyrosine gevoegd. Daarnaast kunnen eiwitten ook contact opnemen met elkaar (interactome). Een ander belangrijk event is het weten waar zo’n nieuw eiwit naar toe moet. Dit wordt gedaan door een signaal volgorde. Deze volgorde zit aan het einde van de aminozuur en wordt herkend door de plek waar het moet zijn. Eiwitten die naar de celkern moeten, zijn voorzien van een kern-localisatie-volgorde.

11. Gen-isolatie en manipulatie

Om genen te isoleren worden moleculaire markers gebruikt. Deze ‘besluiten’ waar het gen van belang zit en waar de punten zijn om het te knippen voor isolatie. Daarna kan dit gen gekopieerd worden en vervolgens gebruikt worden voor onderzoek. Gen-isolatie is een onderdeel van de DNA technologie. DNA technologie is een term dat de technieken inhoudt voor alle gebruiken met DNA zoals manipuleren, isoleren en nog veel meer. De genetische bouwkunde heeft betrekking op alle biologische, medische en agriculturele DNA bewerkingen. De genomica is de analyse van de onderdelen in een cel van een organisme.

11.1 Overzicht: isoleren en versterking van specifieke DNA fragmenten

Om grote onderdelen van het DNA, dat wetenschappers nodig hadden te isoleren, hielden ze het replicatie onderdeel voor de gek. Deze methode wordt versterking genoemd. Dit kan plaats vinden in levende bacteriecellen (in vivo) of in een reageerbuisje (in vitro). Bij in vivo wordt het gen van belang bepaalt en dit wordt het donor DNA genoemd. Dit kan zelfs het hele genoom zijn. Het DNA wordt vervolgens in allerlei stukjes geknipt waarin het verwerkt kan worden. Fragmenten van het DNA worden in een speciaal ontworpen plasmide geïnjecteerd of een bacterieel virus dat het stukje DNA kan dragen en versterken (vectors). Elk vector bevat dan recombinant DNA en er ontstaat een kolonie van DNA vectoren. Bij in vitro wordt een stukje DNA dat van belang is gevonden door ‘polymerase chain reaction’ (PCR). Er zitten primers aan dit stukje DNA waardoor dit ‘target’ DNA vele malen gerepliceerd worden.

11.2 Ontwikkelen van recombinante DNA moleculen

Er zijn vele types van recombinante DNA moleculen die gemaakt kunnen worden uit een verzameling van donor DNA en vectoren. Bronnen van donor DNA zijn:

• Als de onderzoeker een collectie wil dat het hele genoom voorstelt, dan wordt het hele genoom gekloond. Om DNA in een vector te laten passen, moet het geknipt worden in kleinere stukjes. Dit wordt gedaan door restrictie enzymen op speciale restrictie plaatsen door een fosfordiester van het DNA te verwijderen. Een andere eigenschap van restrictie enzymen is dat ze ‘plakkerig’ zijn. Deze enzymen komen een bepaald DNA stuk tegen, een DNA palindrome, en zorgen dat deze strengen uit elkaar worden gehaald. Vervolgens kunnen hier andere complementaire DNA fragmenten aanbinden. Vandaar dat deze enzymen ‘plakkerig’ worden genoemd. Deze manier van paren wordt ook wel hybridisatie genoemd.

• Als het doel is om een enkel gen te isoleren, de PCR kan gebruikt worden om geselecteerde DNA fragmenten te versterken in vitro. Dit wordt gedaan doordat de primers telkens hetzelfde stukje DNA kunnen repliceren.

• DNA kopieën van het mRNA product,genaamd cDNA, kunnen gemaakt worden en geplaats worden in een vector. Dit is handig aangezien het mRNA geen intronen bevat. cDNA wordt gemaakt van mRNA door middel van een speciaal enzym: terugwerkende transcripase. Doordat de OligodT primer hecht aan de polyA staart, kan de transcriptie beginnen. Als deze transcriptie gedaan is, wordt er vanaf de andere kant ook overgeschreven waardoor je uiteindelijk twee nieuwe strengen DNA tegenover elkaar hebt.

Het binden van een donor aan een vector kan door middel van het klonen van DNA fragmenten met plakkerige einden. Dit begint met een splijtings gedeelte bij de vector en bij het donor DNA. Dit knippen gebeurt door het EcoRI endonuclease enzym. Door middel van hybridisatie wordt het donor gedeelte opgenomen in de vector. Vervolgens plakt DNA ligase de ‘gaten’ dicht en ontstaat er de recombinante plasmide.

De versterking van donor DNA in een bacteriële cel bevat de volgende stappen:

• Het kiezen van een vector voor het klonen is belangrijk. Deze kan verschillende ‘maten’ bevatten.

  • Plasmide vectoren zijn de vectoren die al eerder besproken zijn. Een ander voorbeeld hiervan is te zien op bladzijde 377, figuur 11-9.

  • Bacteriofage vectoren zijn vectoren die in vitro een stukje DNA binnenkrijgen. Dit is te zien op figuur 11-10.

  • Ook zijn er vectoren voor grotere DNA injecties. Dit zijn fosmiden voor 35-45 kb informatie en ‘bacterial artificial chromosome’ (BAC) voor 100-200 kb informatie

• Het introderen van het recombinante DNA molecuul binnen een bacteriële cel. Dit kan gedaan worden op drie manieren. 1) Een manier om een plasmide of BAC in een cel te krijgen, is om ze bevoegd te maken door middel van incubatie in een calcium oplossing of door elektrische lading. Hierdoor verandert het membraan potentiaal waardoor de plasmide of BAC binnen gelaten kan worden. 2) Een andere manier is door transductie. Hier bevat een bewerkte faag een hoofd en een staart die DNA in de cel kunnen injecteren. 3) Nog een manier om DNA in een cel te krijgen is door middel van bacteriële kolonies; oftewel een infectie.

• Het herstellen van de versterkte recombinante moleculen. Het DNA wordt hierbij geïsoleerd door middel van enzymen.

Recombinant verzamelingen door middel van het klonen van vectoren worden genomische en cDNA bibliotheken genoemd

11.3 Een kloon van belang vinden

De bovenstaande voorbeelden worden als “shotgun” klonen aangeduid, aangezien een wetenschapper een hele hoop DNA met vectoren in een grote pan stopt en hoopt op een combinatie tussen het DNA en de vector. Dit kan op een preciezere manier; namelijk door gebruik te maken van probes die het gewenste kloon detecteren. Dit doen ze door middel van het vinden van de juiste DNA sequentie of door middel van een gevonden eiwit. Het vinden van de juiste DNA sequentie wordt gedaan door eerst kolonies te maken en vervolgens deze op een absorberend membraan te plaatsen. Vervolgens wordt dit membraan met een radioactieve probe geïncubeerd. Uit de ‘radioactieve’ kolonie worden cellen gehaald en vervolgens worden deze verder gekloond. Een membraanvel met radioactieve bindingsstoffen wordt een autoradiogram genoemd. Het vinden van het juiste eiwit wordt gedaan door middel van antilichamen: eiwitten die andere cellen aanvallen. Voor verdere duidelijkheid zie figuur 11-14 op bladzijde 383.

In vele gevallen zijn er alleen geen probes bekend nog van een belangrijk gen, waardoor de bovenste methode afvalt. Hiervoor is er functionele complementatie (ook wel eens mutant redding genoemd). Dit begint met het maken van een bibliotheek dat het wilde type a⁺ recombinant donor bevat. Vervolgens worden recessieve mutanten a^- getransformeerd met de bibliotheek. Daarna worden de klonen uit de bibliotheek die getransformeerde cellen produceren met het dominante a⁺ fenotype. Als laatste worden de a⁺ genen van de succesvolle kolonies gehaald.

Recombinant-DNA technieken, die afhangen van complementariteit ten opzichte van een gekloonde DNA probe, zijn blotting en hybridisatie systemen. Deze identificeren specifieke klonen, restrictie fragmenten of mRNA’s voor het meten van de specifieke maat van het DNA of RNA. Blotting wordt gedaan door middel van gel electrophoresis (figuur 11-15 op bladzijde 385).

11.4 Het determineren van een base sequentie van een DNA segment

Om de functie van het kloon van belang te begrijpen, is het makkelijker om de base sequentie te ontdekken dan de eiwitproductie. Dit wordt gedaan door middel van dideoxy sequencing (of Sanger sequencing). Hier wordt er gebruik gemaakt van een dideoxynucleotide trifosfaat (ddNTP): een speciaal bewerkte nucleotide. Het heeft de kracht om DNA synthese te blokkeren. Om dit in kaart te brengen, is het handig om figuur 11-18 op bladzijde 389 te bestuderen.

11.5 Uitlijnen van genetische en fysische kaarten om specifieke genen te isoleren

Geen tentamenstof

11.6 Genetische bouwkunde

Muizen zijn de meest belangrijke modellen voor de genetica van zoogdieren. Er zijn twee strategieën voor het voor de transgenesis van muizen:

• Ectopische invoegingen: transgenen worden random in het bevruchte ei gevoegd om te kijken hoe dit resulteert in het muis-zijn. Een nadeel van deze techniek is dat de expressie van het random ingespoten gen abnormaal kan zijn (positie effect), omdat de locale chromosoomomgeving de normale regulerende genen mist. Een ander nadeel is dat er recombinatie en mutatie kan optreden bij de ingevoegde DNA sequenties.

• Gen richten: de transgene sequentie wordt ingevoegd op de locatie dat eigenlijk bezet wordt door een homologe sequentie. Het transgen vervangt dan het homologe gen. Één vorm hiervan is gen vervanging. Hierbij ontkom je aan de nadelen van ectopische invoegingen. Een andere vorm hiervan is gen knockout. Hier wordt een inactief gen geïnjecteerd.

Bij beide methoden wordt er gekeken hoe dit resulteert in de nakomelingen.

12. Regulatie van genexpressie bij bacteriën en hun virussen

Jacob, Monod en Lwoff hebben ontdekt dat er mechanismen op het DNA zitten die ervoor zorgen of een gen wel of niet tot expressie komt. Dit mechanisme wordt een repressor genoemd. In dit hoofdstuk zal de genexpressie van bacteriën besproken worden.

12.1 Genregulatie

Cellen hebben twee mechanismen nodig die 1) de omgeving zouden moeten herkennen waarin ze de transcriptie van relevante genen moeten activeren of onderdrukken en 2) ze moeten de mogelijkheid hebben om elke transcriptie van elk gen of genengroep aan of uit te zetten als een soort schakelaar. Er zijn twee genetische schakelaars bij prokaryoten:

• De promoter bepaalt waar de transcriptie begint. Deze bindt vervolgens aan de polymerase om daadwerkelijk aan de slag te gaan. De promoter is nodig om te starten.

• Het andere type DNA-eiwit bepaald of deze promoter aan de slag mag gaan. De eiwitten die bij het startpunt van de promoter heten activatoren of onderdrukkers. Bij bacteriën worden de onderdrukkers operatoren genoemd. Daarnaast zijn er activatoren die op de plaats moeten zitten, present moeten zijn, om translatie te starten. Dit wordt positieve regulatie genoemd. Negatieve regulatie is wanneer een onderdrukker niet op de plek zit, absent is, waardoor de transcriptie gewoon kan door gaan.

Om deze activator en repressor te spelen, moeten deze in twee fasen voorkomen: binden aan en los zijn van het DNA. Daarnaast hebben deze activator en repressor twee kanten. Een daarvan is de DNA-binding plaats waar ze aan het DNA kunnen binden. De andere kant betreft de allosterische kant en is de plaats waar de effector kan binden. Deze effector zet de activator of repressor in een actieve of non-actieve status (binden of niet binden). Als de effector bindt aan de activator dan zal deze binden aan het DNA en kan er transcriptie plaatsvinden. Als de effector aan de repressor bindt dan zal deze niet binden aan het DNA en kan er transcriptie plaatsvinden.

Deze activator en repressor komen ook in het Lac-circuit voor. Hierbij treedt lactose op als de activator als deze in de cel present is en als repressor als deze absent in de cel is. Het metabolisme van lactose heeft twee enzymen nodig: 1) een permease voor het transporteren van lactose in de cel en 2) β-galactosidase om lactose te veranderen in glucose en galactose. Daarnaast zijn er structurele genen die worden aangegeven door Z, Y en A. Transcriptie dat door het bovenstaande gecontroleerd wordt, heet coördinatief gecontroleerd.
Ook heeft het Lac-systeem een aantal regulerende componenten:

• Het gen voor de Lac repressor. Dit wordt aangegeven met de letter ‘I’. Dit gen houdt de transcriptie tegen.

• De Lac promoter plaats (P) waar de RNA polymerase bindt om de transcriptie te kunnen starten.

• De Lac operator plaats (O) is waar de lactose bindt voor de transcriptie en ligt net voor de structurele genen.

De delen P, O, Z, Y en A worden samen het operon genoemd en zijn het ‘systeem’. Wanneer er geen lactose in de cel is, kan de repressor vrij zijn gang gaan en zal er geen mRNA geproduceerd worden. Wanneer er wel lactose in de cel is, kan de repressor niet binden aan de O en zal er wel mRNA geproduceerd worden. Dit laatste wordt inductie genoemd. De delen die de repressor van zijn werk houden worden dan ook inducters genoemd. Om dit allemaal in kaart te brengen, kan figuur 12-6 op bladzijde 413 gebruikt worden.

12.2 Ontdekking van het Lac-systeem: negatieve controle

Doordat er enzymen afgegeven worden, voordat de officiële reactie er is, is dit een indicatie dat de cel een snel en effectief mechanisme heeft voor het aan- en uitzetten van genexpressie; door middel van omgevingsfactoren.
Om het Lac-systeem te begrijpen, hebben Jacob en Monod de consequenties van mutaties bekeken. Dit is best lastig om te doen, aangezien de enzymen die nodig zijn tijdens het experiment afgebroken worden. Hierdoor hebben ze een sterkere inducer gebruikt: IPTG. Ook doordat ze gebruik maakten van partiële diploïde chromosomen, waardoor ze onderscheid konden maken tussen de mutaties in het regulerende DNA (Lac operator) en in de mutaties in het geproduceerde eiwit (Lac repressor gedecodeerd door het ‘I’ gen). De O^C en de I^- worden constitutieve mutaties genoemd, aangezien deze tot uiting komen in elke omstandigheid. Het maakt hierbij dus niet uit dat de inducer wel of niet aanwezig is.
Operator mutaties onthullen dat zo een plaats, constitutieve mutatie, cis is. Dit betekent dat de repressor niet aan het overstaande chromosoom kan binden, aangezien daar die constitutieve mutatie zit en toch wel zijn werk doet. Dus zal alleen het eigen chromosoom werken. Mutaties in het coderende gen (I) laten zien dat deze wel kunnen werken. Als één van de coderende genen is uitgeschakeld, zal de andere coderen voor beide strengen. Dit betekent dat deze coderende genen trans zijn. Een andere mutatie is de I^S mutatie. Deze zorgt ervoor dat het gen zijn werk niet kan doen, ookal is er een inducer. Dit betekent ook dat het gen dominant is over I⁺.
De Lac-promoter gedraagt zich ook als een cis.

12.3 Katabolitische repressie van het Lac-operon: positieve controle

Als een cel energie wil halen uit lactose, dan moet de cel aan twee voorwaarden voldoen: 1) er moet lactose in de cel zitten en 2) er moet geen glucose in de cel zitten, aangezien anders de cel voor het betere glucose kiest. Als ze beide voorkomen in de cel dan onderdrukt glucose lactose. Dit wordt katabolische repressie genoemd. Dit wordt gedaan door een activator eiwit, waar we zo meteen nog op terug komen.
De cel wil zo veel mogelijk koolstof-atomen gebruiken om energie te makken. Een mechanisme hiervoor is het buitensluiten van lactose. Een andere manier is om operon expressie regulatoren te gebruiken door middel van kataboliten. Dit wordt gedaan door middel van ‘cyclic adenosine monophosphate’ (cAMP). Wanneer de glucose waarde hoog is, is het niveau van cAMP laag. Wanneer de glucose waarde laag is, is het niveau van cAMP hoog. Om cAMP te laten werken, is er nog een ander eiwit nodig: ‘catabolite activator protein’ (CAP). Als de cAMP bindt aan de CAP, kan de CAP binden aan de CAP-bindingsplaats. Hierna kan de polymerase zijn werk toen en kan de transcriptie beginnen. Als de cAMP hoeveelheid laag is, kan de transcriptie niet beginnen. Het Lac-operon heeft een toegevoegd mechanisme om controle uit te voeren wanneer het operon inactief is, maar wel als er glucose of lactose in de buurt is.

De structuur van de hechtingsplaatsen op DNA zijn ingewikkeld. De CAP-cAMP binding is bekend, maar hoe dit er precies uitziet is nog niet bekend. Wel weten de wetenschappers dat ze symmetrisch zijn. De DNA-sequenties zijn daarbij rotationeel: als je ze omdraait, zijn ze weer identiek aan elkaar. Uit het lac-operon model kunnen we halen dat DNA ‘onbeschikbaar’ is, wanneer regulerende eiwitten binden aan de bijbehorende operator plaatsen. Het exacte patroon van binding zal afhangen van welke genen uitgeschakeld zijn en of activatoren of repressors bepaalde operons reguleren.
De inducer-repressor werking is een voorbeeld van repressie, of negatieve controle, waarbij expressie normaal gesproken geblokkeerd wordt. De CAP-cAMP-binding is een voorbeeld van activatie, of positieve controle, omdat het expressie activeert.

13. Regulatie van genexpressie bij eukaryoten

Dolly was het eerste gekloonde én levende schaap. Dit was voor de wetenschap schokkend, aangezien men toen niet wist dat dit kon. De wetenschappers dachten dat klonen niet mogelijk was, aangezien ze dachten dat je mannelijke en vrouwelijke geslachtscellen nodig hebt om een embryo te laten ontwikkelen. In dit hoofdstuk zal het gaan over de genexpressie bij eukaryoten.

13.1 Transcriptionele regulatie in eukaryoten: een overzicht

Een cel bestaat uit de eiwitten dat het produceert. Ook is RNA erg belangrijk voor een cel, omdat deze een belangrijke activiteit in de cel regelt: transcriptie. Vervolgens kan de promoter, op het niveau van genexpressie, geactiveerd of geïnhibeerd worden door verschillende mechanismen. De activatie is nodig om de polymerase te laten binden, waarna de transcriptie kan beginnen. Eukaryoten hebben meer DNA dan prokaryoten. Ook zit het DNA van eukaryoten verpakt in nucleosomen die weer chromatinen vormen. Een ander verschil is dat de normale status van bacteriën voor transcriptie altijd aan staat. Als er geen enzymen de polymerase blokkeren, kan de transcriptie beginnen. De normale status van eukaryoten staat altijd uit en heeft vele mechanismen, enzymen en eiwitten nodig om de transcriptie te starten. Daarnaast zijn er nog drie andere verschillen: 1) eukaryoten gebruiken drie soorten polymerases en bacteriën één, 2) eukaryoten gaan van 5’ naar 3’ en de intronen worden eruit gehaald en 3) polymerase 2 is veel complexer dan zijn bacteriële tegenhanger.
Om transcriptie te beginnen werkt de polymerase 2 samen met de GTF’s om zo aan de promotor-proximal elementen te binden. Deze elementen zijn nodig voor efficiënte transcriptie. De basenvolgorde van deze elementen zijn als eerst de CCAAT box en verder stroomopwaarts is een GC-rijk segment. Door middel van enhancers wordt de cis-interactie aangezet.
Uiteindelijk hebben de regulerende eiwitten de volgende functionele domeinen nodig:

• Een domein dat de DNA-sequentie kan ontrafelen om te beginnen.

• Een domein dat communiceert met een of meer eiwitten van de transcriptie.

• Een domein dat communiceert met eiwitten die gebonden zijn bij regulerende DNA sequenties, zodat ze coöperatief aan het werk kunnen gaan.

• Een domein dat de chromatine dichtheid beïnvloedt.

• Een domein dat de fysiologische condities in de cel meet.

13.2 Lessen van gist: het GAL systeem

Om extracellulaire galactose in de cel te krijgen, transporteert de cel het naar binnen en maakt er glucose van. Dit wordt gedaan met behulp van een aantal genen en enzymen die helpen bij de katalysatie. Net zoals bij het Lac-operon, zijn de GAL-genen actief bij de absentie van glucose. Gal4 is het best bestudeerde GAL-gen bij eukaryoten en zorgt voor het opzoeken van een bepaalde DNA sequentie om aan te binden. Het is een enhancer en ligt stroomopwaarts waardoor het ook wel eens ‘upstream activation sequences’ (UAS) wordt genoemd. Als één van de genen, gal1, 2 of anderen, worden verwijderd, zal het gen stil zijn.
De gal4 heeft naast het ontdekken van de juiste DNA sequentie, ook het domein van activatie. Dit soort eigenschappen kunnen onderzocht worden door gebruik te maken van rapporteer genen. Zo’n gen wordt geplaatst bij het regulerende gen. Vervolgens wordt het level van voorkomen van het rapporterende gen gemeten.
Normaal gesproken inhibeert gal80 de GALgenen, aangezien bij een mutatie de GALgenen tot expressie komen terwijl er niet eens galactose hoeft te zijn. Dit is precies het omgekeerde bij GAL3. Hierbij wordt bij een mutatie het GAL3-gen zo veranderd dat het normale GALgenen inhibeert, terwijl deze normaal de GALgenen activeert.
De activiteit van transcriptionele, regulerende eiwitten bij eukaryoten wordt vaak gecontroleerd door interacties met andere eiwitten. De vaardigheid van gal4, net zoals vele andere regulerende genen, om te functioneren in verschillende eukaryoten geeft aan dat eukaryoten over het algemeen dezelfde transcriptie mechanismen hebben.

Sommige eiwitten gebruiken co-activatoren om het inwijdingsproces te beginnen. Dit begint dan bij het communiceren met een mediator complex. Een andere manier is wanneer gal4 aan een TBP bindt en vervolgens aan een TATA-box. Hierdoor wordt de TFIID geactiveerd waarna de polymerase 2 naar de promoter wordt gebracht.

Gistcellen paren op een specifieke manier. Er zijn van een bepaald gist drie soorten cellen: a, α en a/α. Als deze soorten gaan paren, dan scheiden de a- en α-cellen een bepaald feroom, sexhormoon, af. Dit wordt opgevangen door de andere soort cel waardoor deze elkaar aantrekken. De a/α-cellen paren niet. De ‘mating-type locus’ (MAT) bepaalt welke soort eruit komt. Als de MATa locus er is, dan zal het een a-cel worden. Als de MATα locus er is, dan zal het een α-cel worden. Daarnaast zorgen ze ervoor dat het gen voor de andere cel, a of α, niet tot expressie komt. Dit gebeurt bij de a/α-cellen voor beide cellen waardoor beide cellen niet tot expressie komen.

13.3 Dynamische chromatines

Het eerste mechanisme is dus dat activatoren kunnen communiceren met subunits van het eiwitcomplex die helpen of tegenwerken bij het transcriptie-inwijdings-proces. Een tweede mechanisme voor het beïnvloeden, van gentranscriptie bij eukaryoten, is het ontrollen van de chromatine structuur. Een belangrijk kenmerk van de chromatine structuur is dat het geërfd kan worden door een volgende cel. Dit is een vorm van epigenetische overerving. De chromatine structuur is het DNA dat op dat stukje histon ligt. Een manier om het DNA te lezen dat nodig is, wordt gedaan door het remodeleren van de chromatine. Hierbij rolt het DNA een beetje heen en weer van het chromatin. Vandaar dat chromatines ook wel eens dynamisch worden genoemd. Bekijk hiervoor eventueel figuur 13-13 op bladzijde 452.

Een nucleosoom bestaat uit acht histonen met DNA erom heen gewikkeld. Door middel van histonstaarten maakt de histon verbinding met de fosfaatgroepen van het omliggende DNA. Daarnaast zijn er zo’n 150 verschillende vormen van histonen. Daarbij kunnen histonen acetyl- of methylgroepen aangeplakt krijgen. Dit kan op veel verschillende manieren waardoor er ook een histoncode is. De histonen kunnen vele acetylgroepen bevatten (hyperacetyleerd) of juist weinig acetylgroepen bevatten (hypoacetyleerd). Het enzym dat verantwoordelijk is voor het toevoegen van acetylgroepen aan histonen is acetyltransferase (HAT). Er zijn drie manieren waarop acetylgroepen helpen bij het makkelijk maken van genexpressie:

1. De toevoeging van acetylgroepen aan specifieke histon plaatsen zorgt voor de interactie tussen het DNA en het histon-octameer. Hierdoor kan het octameer eerder langs het DNA schuiven naar een nieuwe positie.

2. De toevoeging van acetylgroepen kan de interactie tussen naburige nucleosomen veranderen, resulterend in een meer open chromatin.

3. Histonacetylering, in samenwerking met andere histonmodificaties, beïnvloedt de binding van regulerende eiwitten aan het DNA.

Ook is het mogelijk om actylgroepen te verliezen. Dit wordt gedaan door histon deacetylases (HDACs). Deze eiwitten spelen een rol bij genrepressie. Het verliezen en verkrijgen van acetylgroepen wordt georganiseerd door genen die een sequentie specifieke activator of repressor hebben.

Het erven van chromatines wordt gedaan doordat een histonketting in tweeën wordt gesplitst, net zoals bij DNA. Elke streng bevat een helft dat uit nieuwe histonen bestaat die geen code nog hebben. De andere helft bevat dan automatisch de oude histonen die wel een code hebben.

Een andere manier om de chromatine structuur te beïnvloeden is door middel van methylatie. Dit is geen histonbewerking, maar aan het DNA residu (koolstofatoom 5) wordt een methylgroep toegevoegd. Bij zoogdieren wordt een methylgroep toegevoegd aan de C-base. Vlak bij de promoter worden geen C-basen gemethyliseerd, aangezien deze methylgroepen te maken hebben met inactivatie. Deze plaatsen worden CpG-eilanden genoemd. Methylisatie kan geërfd worden door de volgende cel. Op welke manier dit gebeurt is te zien in figuur 13-17 op bladzijde 455. Wanneer één streng van de twee een methylgroep bevat, dan wordt dat hemimethyliseerd genoemd.

13.4 Korte termijn activatie van genen in een chromatine omgeving

In een chromatine omgeving worden de factoren zo gesteld dat er transcriptie kan plaatsvinden. Dit gebeurt doordat verschillende enhancers op een kleine afstand van elkaar binden zodat er een versterkt effect qua activatie voor transcriptie is. Dit wordt synergie genoemd. Deze bindingen kunnen ervoor zorgen dat er een enhanceosoom ontstaat. Bij mensen is het β-interferon het enhanceosoom. Dit enhanceosoom zorgt ervoor dat er een bindingsplaats is voor GCN5. De GCN5 zorgt ervoor dat een acetylgroep tussen de twee nucleosomen wordt gevoegd. Na zijn taak gedaan te hebben, verlaat de GCN5 zijn bindingsplaats. Vervolgens komen daar CBP (co-activator), SWI-SNF en RNA polymerase 2 voor in de plaats. De TATA-binding eiwit (TBP) bindt aan de nieuwe en beschikbare TATA box. Hierdoor kan er transcriptie plaatsvinden.

Om ervoor te zorgen dat enhancers niet oneindig genen over zullen schrijven, zijn er enhancer-blokkerings insulatoren. Deze nemen plaats tussen de promoter en de enhancer bindingsplaats waardoor de enhancer niet bij de promoter kan komen. Automatisch resulteert dit in het niet kunnen plaatsvinden van transcriptie.

13.5 Lange termijn inactivatie van genen in een chromatine omgeving

In het begin is er al gezegd dat genen meestal uitstaan en sommige genen staan zelfs hun hele leven uit. Door deze opmerking zijn er twee vragen die van belang zijn om te beantwoorden: 1) waarom hebben organismen genen die altijd inactief zijn en 2) hoe houden organismen deze genen hun hele genen inactief? Om deze vragen te beantwoorden, wordt wederom het paringsgedrag van gist gebruikt. De HMRa en HMLα genen liggen op hetzelfde chromosoom als het MAT-gen. Deze HMRa en HMLα genen bevatten informatie cassettes voor het inactieve MAT-allel. Deze genen zijn dus standaard uitgeschakeld. Dit is een voorbeeld van ‘transcriptional gene silencing’. Het tegenovergesteld zijn post-transcriptional gene silencing. Een voorbeeld hiervan is het RISC-complex dat besproken is in hoofdstuk 9.
Naast de HMRa en HMLα genen, is er nog het HO-gen. Dit gen dient als een endonuclease en knipt DNA dat nodig is voor de inwijding van switchen (H11). Het switchen zorgt ervoor dat er een ander gen, HMRa en HMLα, op het MAT-gen komt te liggen.

Lange termijn silencing en gen repressie wordt veroorzaakt doordat de chromatines van eukaryoten niet uniform zijn. Chromatines kunnen dicht geconcentreerd zitten, zoals bij heterochromatines. Chromatines die niet dicht geconcentreerd op elkaar zitten, worden euchromatines genoemd.

Bij fruitvliegjes zit de gencode voor oogkleur naast het uiteinde van het X-chromosoom. Normaal hebben fruitvliegjes rode ogen, maar met een mutatie hebben deze vliegjes witte ogen. Nakomelingen hadden alleen rare patronen van wit en rood pigment. Dit kwam doordat er inversie was opgetreden. Het euchromatine gedeelte van het X-chromosoom, voor het witte gen, lag nu naast het heterochromatine centromeer. De mogelijkheid van het switchen van euchromatines en heterochromatines wordt ‘position effect variegation’ (PEV) genoemd.

De isolatie van eiwitten die nodig zijn voor de formatie van heterochromatines, zoals HP-1 en HMTase, is mogelijk gemaakt door de isolatie van een mutant bij een fruitvliegje dat PEV suppressed of enhanced.

13.6 Geslachtsspecifieke silencing van genen en hele chromosomen

Genomische imprinting is het erven van autosomale genen op een specifieke manier. Maternal imprinting is wanneer het allel van de moeder stilgelegd wordt. Paternal imprinting is wanneer het allel van de vader stilgelegd wordt. Een manier om allelen stil te leggen is door methylgroepen eraan toe te voegen. De methylgroepen gedragen zich als een blok op het tegen eiwitten die voor transcriptie moeten binden. Dit imprinten heeft nog meer factoren en die zijn te bestuderen op bladzijde 466: figuur 13-27 en 13-28.

Bij vrouwelijke zoogdieren wordt één van de twee X-chromosomen voor hun hele leven stilgelegd. Dit is mogelijk door de doseringscompensantie van het X-chromosoom. Hierdoor krijgen de vrouwen dezelfde enkele dosering als mannen. Daarnaast levert het Y-chromosoom bijna alleen maar informatie voor het ontwikkelen van een mannelijk wezen. Het inactieve X-chromosoom wordt het lichaampje van Barr genoemd.

14. De genetische controle in de ontwikkeling

Om de ontwikkeling van een eicel te ontdekken, embryologie, maakte Morgan gebruik van fruitvliegjes. Hier zijn twee mutanten uitgenomen, namelijk de bithorax (twee paar vleugels) en de antennapedia (voeten op de plek van de antennes). Deze mutaties zijn homeotisch, aangezien een gelijk lichaamsdeel is getransformeerd om een ander deel voor te stellen.

14.1 De genetische benadering richting ontwikkeling

Delen van embryo’s werden in andere embryo’s gestopt om vervolgens te kijken wat er gebeurt. Sommige delen van amfibieën groeiden extra aan, zoals vingers, als deze methode wordt toegepast. Dit worden ‘organizers’ genoemd, omdat ze omliggend weefsel kunnen beïnvloeden. Deze produceren morfogenen: moleculen die verschillende reacties geven op omliggend weefsel, op een concentratie afhankelijke manier. Vaak met respect naar de onderdelen die al op die plek moeten zitten. Deze genetica bevat vier vragen die van belang zijn: 1) welke genen zijn belangrijk voor de ontwikkeling?, 2) waar en wanneer zijn deze genen actief?, 3) hoe wordt de expressie van ontwikkelingsgenen gereguleerd? en 4) welke moleculaire mechanisme hebben invloed op de embryo ontwikkeling?.

14.2 De genetische gereedschapskist voor de fruitvlieg ontwikkeling

Huishoud genen zijn essentiële genen die coderen voor eiwitten die weer overal in het lichaam bij processen worden gebruikt. Bij embryo genetica wordt er gekeken naar eiwitten die zorgen voor de opbouw, zoals organen. De genetische gereedschapskist voor de ontwikkeling van een dier bestaat uit een klein gedeelte van alle genen. Alleen een klein deel van alle genen zorgen voor de ontwikkeling op hele specifieke manieren. De meeste genen worden vernoemd naar hun functie, bepaald door mutaties.

Homeotische genen transformeren de identiteit van ‘serially reiterated structures’. Deze zorgen voor de onderdelen, mond, neus, armen, etc., dat ze op de juiste plek zitten en geproduceerd worden. Bij fruitvliegjes bestaan er hox genen die voor acht delen op het lichaam coderen. Als eentje hiervan mist, kan het vliegje niet levensvatbaar zijn. Deze genen zijn samen geclusterd in twee gencomplexen op het derde chromosoom.

Twee technologieën voor het visualiseren van gen expressie bij embryo’s zijn1) de expressie van RNA transcripten gevisualiseerd door situ hybridisatie en 2) de expressie van Hox eiwitten gevisualiseerd door immunologische methoden (figuur 14-5 op bladzijde 480). Elke technologie hangt af van de isolatie van cDNA dat het rijpe mRNA voorstelt. De patronen van een Hox embryo laten de gebieden, waar de expressie is, zien. Als er een mutatie is, verschuift het Hox gen of is deze groter/kleiner dan normaal. Als een Hox gen niet functioneert, dan kunnen onderdelen groeien, maar de identiteit klopt niet helemaal. Hox genen lijken allemaal op elkaar, ze hebben dezelfde sequentie, en deze worden gezamenlijk de homeobox genoemd. Deze box codeert voor een eiwitdomein, het homeodomein, dat 60 aminozuren bevat. Vele gereedschapskist genen coderen voor transcriptie factoren die de expressie van andere genen reguleren.

De Hox genen zijn ook bij vele andere dieren gevonden en lijken zeer veel op elkaar. Dit is een bewijs dat ze eenzelfde voorouder hebben en dat Hox genen al zeer oud zijn. Hierdoor hebben ze een belangrijke rol in de ontwikkeling van het organisme.

14.3 Het definiëren van de gehele gereedschapskist

Niet alleen Hox genen hebben te maken met de ontwikkeling van een organisme. Eerst werd er alleen gekeken naar levende vliegjes, maar eigenlijk waren de onderzoekers op zoek naar mutanten die niet tot uiting komen (meestal dodelijk zijn). Dus bedachten ze een schema dat alle genen in elke mogelijke zygoot zou bevatten. Genen die worden voorzien door de moeder heten moeder-effect genen. Fenotypen van nakomelingen, die alleen afhangen van de moeder, zijn mutant als de moeder dat ook is. Bij fruitvlieg larven kunnen de lichamen goed bestudeerd worden. De locus kan bepaald worden en hierbij ook de mutatie. Voor elk gereedschapskist gen, zijn er drie belangrijke informatiepunten: 1) het gemuteerde fenotype, 2) het patroon van genexpressie en 3) het natuurlijke genproduct.

Er zijn een aantal genen die nodig zijn voor het organiseren van de anteroposteriore en dorsoventrale lichaamsas. Deze zijn verdeeld in de volgende groepen:

1. De eerste klasse bevat de genen voor het opzetten van de anteroposteriore lichaamsas. Van belang hierbij is het bicoide gen: bicoide mutanten missen een anterior gedeelte.

2. De tweede klasse bevat gaten genen: deze zorgen wel of niet voor het missen van segmenten.

3. De derde klasse bevat de paar-regel genen: deze zorgen dat beide segmenten gemaakt worden op de juiste plek. De even-skipped genen zorgen voor één set van de onderdelen van een lichaam en de odd-skipped genen zorgen voor de complementaire set van onderdelen.

4. De vierde klasse bevat onderdeel-polariteit genen: deze zorgen voor patronen binnen elk onderdeel.

5. De vijfde klasse zijn de Hox genen. Zij beïnvloeden het aantal onderdelen niet, maar wel de verschijning van één of meerdere onderdelen.

In figuur 14-15 op bladzijde 487 zijn de patronen van de verschillende klassen te zien. Hierin is te zien dat de ontwikkeling van een organisme in stappen gaat. Eerst is de gaten structuur te zien, vervolgens de paar-regel genen en de onderdeel-polariteit genen. Telkens wordt het patroon ingewikkelder. Er zijn ook andere aanwijzingen dat dit zo gebeurd, omdat de gaten genen de rest van het proces beïnvloeden en omdat de geproduceerde eiwitten ook op die manier aangetast worden.

De meeste gereedschapskist eiwitten beïnvloeden direct (als transcriptiefactoren) of indirect (als onderdelen van signalerende paden) de genregulatie. Een voorbeeld van een signalerend pad is het ligand-pad (figuur 14-16 op bladzijde 489). De receptor op het membraan wordt geactiveerd door een ligand eiwit waarna een TF-eiwit geactiveerd kan worden. Dit gebeurt op twee manieren: 1) fosforlysatie of 2) simpelweg door een receptor signaal. Deze worden in de celkern verplaatst, waarna het op een enhancer terecht komt en verder zijn signaal kan uitvoeren.

14.4 Ruimtelijke regulatie van genexpressie tijdens de ontwikkeling

De ruimtelijke regulatie van genexpressie wordt gereguleerd door cis-werkende regulatie elementen. Deze bevatten wel veel actieve elementen. De positionele informatie wordt bepaald in 3D. Deze positie kan bepaald worden door mate van gradiënten en genactivatie. Het bicoide kan in het begin van het embryo vrij door alles drijven, aangezien er geen membranen (syncytium) zijn. Hoe meer bicoide genen, hoe meer gradiënten en hoe meer expressie. De bicoide genen zijn coöperatief. Dit houdt in dat bicoide bindingen andere plaatsen aantrekkelijker maken voor meer bicoide genen. Hoe de activatie van zo'n expressie tot uiting komt, is te zien door testen in vivo uit te voeren. Cis-werkende genen worden geïsoleerd, samengevoegd en vervolgens weer aan de rest van het gen gezet. Dit wordt gedaan met behulp van de promotor en het reporteer gen gemaakt. Vervolgens kunnen recombinanten in gastembryo’s worden gebracht. De locatie wordt duidelijk door het reporteer gen.

De expressie van elk paar-regel gen, de zeven strepen, is het eerste teken van organisatie in de embryo. Dit wordt streep per streep aangemaakt door de som van alle cis-werkende elementen. Een voorbeeld van het aanmaken van zo'n streep is te zien op bladzijde 493, figuur 14-20.

Segmenten kunnen veranderd worden door de integratie van Hox elementen. De activiteit van de moederlijke effecten, gat-, paar-regel- en segment-polariteit eiwitten bepalen de basis van het larve lichaampje. De Hox eiwitten beïnvloeden dit op twee manieren: 1) Hox gen expressie gebeurt in verschillende domeinen over de anteroposteriore as door vele segment eiwitten en 2) regulatie van doel genen door Hox eiwitten. Een voorbeeld van punt twee is de expressie van Distal-less (Dll). Hierbij blokkeren twee Hox eiwitten, Ultrabithorax en Abdominal-A, de productie van ledematen.

Combinatie en coöperatieve regulatie van gen transcriptie zorgen voor specifieke ruimtelijke patronen van genexpressie. Hierdoor is er meer diversiteit onder de soorten.

14.5 Posttranscriptionele regulatie van genexpressie tijdens de ontwikkelingen

RNA splicing, mRNA translatie in eiwitten en miRNA hebben ook invloed op het uiteindelijke resultaat van de eiwitten.

Bij fruitvliegjes is er een doublesex gen (dsx) dat een centrale rol speelt in de seksuele identiteit van lichamelijk weefsel. Als er nulmutaties zijn, dan is het een intersex en is er geen weefsel aanwezig dat verschilt tussen man en vrouw. Er zijn twee dsx genen: eentje voor het mannetje en de andere voor het vrouwtje. De activiteit van de twee isoformen verschillen, omdat het vrouwelijke dsx sommige doelgenen activeert die het mannelijke dsx onderdrukt. De alternatieve vormen van dit gen worden gemaakt door alternatief splicen. Tra is zo een eiwit en beïnvloedt het splitsen van het dsx RNA transcript.

De C. Elegangs heeft de genetica veel geholpen door de rol van posttranscriptionele regulatie op RNA niveau te laten zien. Hier horen twee mechanismen bij: 1) controle van translatie door mRNA bindingseiwitten en 2) miRNA genexpressie controle.

In alle vier de cellen, blastomeer, van de C. Elegangs zitten de gereedschapseiwitten. Alleen wordt dit niet in elke cel tot uiting gebracht. Dit komt door bindingseiwitten die de bepaalde genen onderdrukt of stimuleert.

Mutaties in de heterochronische genen van de C. Elegangs laten zien hoe de controle over de ontwikkelingstiming is. Dit brengt ons naar een reguleringsmechanisme door middel van miRNA. Het zorgt ervoor of genen wel of niet onderdrukt worden. Er zijn vele miRNA’s die allemaal een specifieke rol hebben.

14.6 Van vliegen naar vingers, veren en vloerplaten: de vele rollen van individuele gereedschapskist genen

De gereedschapskist eiwitten en regulerende RNA’s hebben vele rollen tijdens de ontwikkeling. Het hedgehog gen is een gereedschapskist eiwit van het fruitvliegje. Het scheidt een signaal af in de cellen. De hedgehog genen zijn ook gevonden in muizen, kippen en meer. Er zijn er nu drie gecategoriseerd: 1) Sonic hedgehog (Shh), 2) Indian hedgehog en 3) Desert hedgehog. De Sonic hedgehog, een morfogen, wordt gemaakt door de ‘zone of polarizing activity’ (ZPA). Het komt voor bij kippen en andere gewervelden. Het zorgt voor de anteroposterior polariteit van de ledematen en zijn vingers. Daarnaast heeft Shh nog vele andere doelen. De andere twee hedgehog genen worden niet duidelijk gemaakt.

De meeste gereedschapskist genen hebben meerdere rollen in verschillende weefsels en celtypen. De specificiteit van hun optreden wordt bepaald door de combinatie met andere gereedschapskist genen.

14.7 Ontwikkeling en ziekten

Ziekten die door slecht werkende gereedschapskist genen ontstaan, zijn polydactylie, holoprosencefalie en kanker. Polydactylische patiënten hebben meer dan vijf vingers en/of tenen. Dit komt bij vele gewervelde dieren voor. Dit wordt veroorzaakt door het Shh gen. De mutaties zitten niet in dit gen, maar in het cis-werkende element. Hierdoor zijn deze fenotypes vaak dominant en de meeste cis-werkende elementen werken goed.

Holoprosencefalie zorgt voor misvormingen in het brein, neus en andere middenlijn structuren. Het ontstaat door herhalende sequenties in het Shh eiwit. Foetussen met homozygote kapotte Shh genen sterven al snel. Diegene met holoprosencefalie zijn heterozygoot, waarbij het normale gen haploinsufficiënt is.

Ook kanker wordt gestart door een foutlopende ontwikkeling. Hierbij wordt de celdeling niet meer in de hand gehouden. De patched genen coderen voor een receptor dat Hedgehog signalen ontvangt. De foute werken van deze genen ontwikkelen meerdere kankersoorten.

15. Genomen en genomica

Genomica is de studie van het totale genoom van een individu of soorten. Vele planten, schimmels, fruitvliegjes en mensen hebben al genenkaarten. De wetenschappers zijn op dit moment bezig om deze genenkaarten te ontcijferen. Dit kan op een voorwaartse en een omgekeerde manier. Bij de voorwaartse genetica worden mutanten bekeken op hun fenotype en vervolgens kan de functie van het DNA, het RNA en de geproduceerde eiwitten bepaald worden. Omgekeerde genetica kijkt van gen naar fenotype, terwijl de voorwaartse genetica van fenotype naar gen kijkt.

In de biologie wordt tegenwoordig veel gewerkt aan de systeem biologie: de evolutie van soorten op een geologische tijdlijn uitzetten, inclusief de bijbehorende individuele ontwikkelingen tussen soorten.

In dit hoofdstuk zullen er drie grote aspecten uit de genomica besproken worden:

• Bioinformatica analyseert de informatie van het gehele genoom.

• Vergelijkende genomica bekijkt de verschillen en gelijkenissen tussen verwante soorten en niet verwante soorten.

• Functionele genomica gebruikt verschillende methoden, bijvoorbeeld omgekeerde genetica, om functies te kunnen bepalen.

15.1 De revolutie van de genomica

Wetenschappers begonnen met het klonen van een enkel gen en vervolgens keken ze naar het volgende gen. Om de locus te bepalen, moest er DNA geïsoleerd worden waarna het gekloond kon worden. Samen met een heel team konden wetenschappers hieraan werken om het daarna te publiceren. Deze samenwerkende teams vallen onder de naam genoom projecten. Het was een stuk handiger om een sequentie uit een genoom van een model organisme op te vragen aan een ander project, dan om zelf het genoom te bepalen en dan pas naar het benodigde gen op zoek gaan.

De belangrijkste vraag is, wanneer we het hele genoom in kaart hebben gebracht, hoe we het moeten lezen. Daarnaast zijn de technieken sinds 1990-2000 zeer ontwikkeld. De snelheid waarmee basen volgordes bepaald kunnen worden, neemt nog steeds toe.

Het verzamelen van grote data aan basenparen en volgordes, kan later gebruikt worden om informatie over een specifiek gen te verkrijgen. Ook kan er gekeken worden naar ziektebeelden op genniveau.

15.2 Het verkrijgen van de volgorde van het genoom

De hoogste resolutie waarin een genoom verkregen kan worden, is op basenparen niveau (A, T, G en C’s). Dit kost helaas heel veel tijd. Daardoor zijn er allerlei andere methoden ontwikkeld die gebaseerd zijn op automatisering. Hieronder zullen enkele methoden beschreven worden.

Een methode is om de sequentie in een gezamenlijke sequentie te vormen. Dit gebeurt in vier stappen:

1. Knip de DNA moleculen van het genoom in miljoenen kleine stukjes.

2. Lees de sequentie van elk segment.

3. Laat de computer de overlappende sequenties, die identiek aan elkaar zijn, samenvoegen.

4. Voeg alle kleine sequenties bij elkaar tot er één grote sequentie is en geen kleine sequenties meer. Nu is er een hele lange zin klaar om te lezen.

Een uitdaging bij deze methode is om de samengestelde sequentie te vormen. Dit wordt gedaan door alle individuele ‘woorden’ in een gezamenlijke sequentie te stoppen. Deze gezamenlijke sequentie is een authentieke representatie van de sequentie op moleculair niveau in het genoom. Het is ook al een doel op zich om een representatieve gezamenlijke sequentie te vinden.

Een andere methode is het in kaart brengen van het hele genoom. Dit wordt ‘whole-genome shotgun’ (WGS) sequencing genoemd. Hierbij wordt het genoom in kleine stukjes geknipt en in kaart gebracht. Deze methode is uit te splitsen in twee soorten: 1) de traditionele WGS op basis van de Sanger dideoxy sequentie techniek en 2) de ‘next-generation’ WGS met een hogere resolutie. De traditionele WGS begint met het construeren van genomische bibliotheken. Dit bevat vele stukjes DNA die het hele genoom representeren. Deze korte segmenten worden in een vector (accessoire chromosomen zoals plasmides, bewerkte bacteriën of kunstmatige chromosomen) gebracht. Om een bibliotheek te maken, moeten restrictie enzymen het DNA in stukjes knippen. Dit wordt gedaan door verschillende enzymen waardoor er ook verschillende lengtes kunnen ontstaan. Daarnaast knippen de enzymen op speciale plaatsen om zo het gewenste stukje chromosoom te krijgen. Door deze twee eigenschappen van de restrictie enzymen ontstaan er vele verschillende stukjes recombinant DNA. Vervolgens zit dit DNA in de vector, waarbij het DNA de gastheercel gebruikt om veel klonen te produceren. De bibliotheek die ontstaat heet een shotgun bibliotheek, aangezien sequenties gelezen worden die random geselecteerd zijn uit het hele genoom zonder informatie over de locatie van deze sequentie. De sequentie wordt vervolgens geamplificeerd met primers die aansluiten op een bepaalde sequentie van het vector DNA. De primers kunnen niet hechten aan het DNA van toepassing, aangezien wetenschappers die sequentie nog niet weten en juist willen ontdekken. Homologe sequenties worden samengevoegd met overlappende klonen. Dit worden continue sequenties genoemd.

De next-generation WGS heeft hetzelfde doel als de traditionele WGS: vele overlappende sequenties lezen die samengevoegd kunnen worden in een continue sequentie.

Er zijn drie grote verschillen in aanpak tussen de twee WGS methoden: 1) next-generation WGS gebruikt geen gastheercellen, maar celvrije reacties, 2) miljoenen DNA fragmenten worden geïsoleerd en parallel in kaart gebracht tijdens elke ronde en 3) geavanceerde vloeistof technologieën, camera’s en andere software maken het mogelijk om de sequentie reacties in extreem kleine reactie volumes te meten.

Next-generation WGS kent vele soorten, maar er zal eentje besproken worden in dit boek. Deze methode bevat drie stappen:

1. Een DNA template bibliotheek van enkel strengs DNA wordt gemaakt.

2. De DNA moleculen uit de bibliotheek worden geamplificeerd door middel van PCR. De enkele moleculen worden immobiel gemaakt, waarna ze op hun molecuullichaam vele DNA strengen verkrijgen. Vervolgens worden ze in putjes gestopt die de sequentie reacties huishoudt.

3. Elk bolletje zit nu in een putje en bevat enkelstrengs DNA. Dit wordt dubbelstrengs door middel van pyrosequencing. De vier basen, dATP, dGTP, dTTP en dCTP, worden langs de putjes gehaald. Wanneer er een base hecht aan zijn complementaire base, zal er een lichtflits uitkomen door de enzymen sulfurylase en luciferase. Elke lichtflits representeert een base waardoor de sequentie gevonden kan worden.

De manier van sequenties maken van het hele genoom komt op hetzelfde neer. Het verschil zit in de complexiteit van organismen. Een bacterie is redelijk makkelijk in kaart te brengen, maar dat is anders bij eukaryoten. Dit komt omdat eukaryoten veel herhaaldelijke sequenties hebben. Deze komen achter elkaar voor, maar ook veel verspreid.

Een probleem bij het lezen van sequenties was hoe al die kleine stukjes weer in elkaar moesten worden gezet. Een manier om dit op te lossen, is om gebruik te maken van de methode paired-end reads. Sequenties die elkaar opvolgen, kunnen aangeven waar het DNA zit; samen met de grootte van de bibliotheek. Er worden hierbij gaten ingevuld (scaffolds of supercontinu) met de berekeningen over de plaats van het DNA en de samengevoegde sequenties. Bij dit fenomeen is figuur 15-8 op bladzijde 519 van belang.

15.3 Bioinformatica: de betekenis van genoom sequenties

De informatie van het genoom bevat naast informatie over het DNA, ook informatie over de bindingsplaatsen voor promoters, polymerase en meer. Een manier om het DNA te lezen, is om de genen sequenties te bepalen voor bijbehorende eiwitten. Dit wordt lastig gemaakt doordat de wetenschappers niet weten welke sequenties introns zijn. Dit komt doordat we 5’ en 3’ eindes niet goed kunnen identificeren ten opzichte van exonen. Een manier om een polypeptide lijst op te stellen is door middel van de genoom sequentie. Deze kan dan mRNA voorspellen samen met de polypeptide sequenties. Deze laten de genen zien, zonder de introns. Hierbij horen de 5’ en 3’ eindes, net zoals de start en stop codons. Sequenties met bovenstaande eigenschappen worden ‘open reading frames’ (ORF) genoemd.

Een andere manier om ORF’s te vinden is door middel van cDNA. Complementair mRNA wordt gekopieerd en is cDNA. cDNA is van belang om twee redenen: 1) cDNA is het bewijs dat een bepaald segment van het genoom is uitgedrukt en dus een gen zal bevatten en 2) cDNA is complementair aan mRNA en zal daarom ook geen introns bevatten. Het kan dus bepalen wat er mist ten opzichte van het DNA. Wanneer alleen de 5’ of 3’ uiteinde gekopieerd wordt door cDNA, dan wordt dat ‘expressed sequence tags’ (EST) genoemd. Deze kunnen de grenzen van genen aangeven.

De sequenties die coderen voor transcriptie en translatie praktijken zijn nog niet goed bekend. Van andere organismen, vaak modelorganismen, zijn vele functies en sequenties van genen wel bekend. Deze kunnen vergeleken worden met genen die nieuw zijn ontdekt. Zo kan er bepaald worden of dit echt coderende genen zijn. Dit kan door middel van de nucleotide sequentie (BLASTn) of door middel van de aminozuur sequentie (BLASTp). Ook kunnen er voorspellingen gedaan worden op basis van codon bias. De triplets zijn degenererend wat inhoudt dat meerdere triplets voor een aminozuur coderen. Sommige triplets coderen vaker voor een aminozuur dan anderen triplets (codon bias). Als de codon matcht door middel van ORF met een al bekend codon, dan is dit een bewijs dat het een echt codon is. Een samenvatting van dit verhaal is te vinden in figuur 15-12 op bladzijde 523.

Voorspellingen van mRNA en de polypeptide structuur van DNA sequenties, hangt af van de integratie van informatie uit cDNA-sequenties, voorspellingen van bindingsplaatsen, polypeptide overeenkomsten en codonbias.

15.4 De structuur van het humane genoom

In het humane genoom zitten vele herhalingen. Daarnaast zijn er vele, oude wegwerp elementen die geen nut hebben, maar simpelweg meeliften van generatie naar generatie. Verder codeert maar ongeveer 3% van het DNA voor exonen. Deze zijn heel klein, terwijl intronen zeer groot zijn. Daarnaast zijn er vele pseudogenen (ORF bijvoorbeeld) die door een mutatie inactief of onfunctioneel zijn geworden. Bewerkte pseudogenen zijn genen waarvan de DNA sequentie door mRNA terug in het genoom terug zijn gevoegd. Eiwitten kunnen geclassificeerd worden op functie, domein of structuur.

15.5 Vergelijkende genomica

Vergelijkende genomica laat de evolutie van soorten zien. Deze genomica laat ook zien hoe bepaalde mutaties, die minder nuttig waren, uitstierven en waarom dat zo was. De fylogenie laat de geschiedenis van een soort zien. Vervolgens kunnen er soorten vergeleken worden met elkaar. Vaak gebeurt het vergelijken tussen gelijke soorten (homologen). Genen die homoloog zijn, worden gevonden door gelijke DNA sequenties of aminozuur sequenties. Wanneer genen van dezelfde voorouder komen, zullen deze op dezelfde locus zitten (ortholoog). Wanneer genen een evolutie doormaken, kan er duplicatie van genen ontstaan waardoor er genen op verschillende loci terecht komen (paraloog).

Ook kunnen karakteristieken tussen soorten, bijvoorbeeld monotremes en eutharian (honden/mensen), verschillen. De genen kunnen bij de ene soort wel voorkomen en bij de andere soort niet. Hier kunnen twee vragen bij gesteld worden: 1) de genen zijn een nieuwe ontdekking van de ene soort en 2) de eigenschappen die de ene soort mist, deelden de twee soorten met een gelijke voorouder, maar de genen zijn verloren gegaan bij de ene soort.

Fylogenetische inferentie kijkt waar de eigenschappen van een soort, terugkomen in een andere soort. Wanneer de eigenschap van belang bij een hele andere groep soorten hoort, heet dit de ‘outgroup’. Vaak is het moeilijk om te kiezen tussen verschillende theorieën over het evolueren van de ene groep, maar de andere groep niet. Daarom gebruiken wetenschappers het principe van parsimony (spaarzaamheid): de voorkeur geven aan de simpelste verklaring die het minste evolutionaire veranderingen heeft meegemaakt.

Syntenie kijkt naar DNA homologen tussen soorten en bepaald in hoeverre de genen hetzelfde zijn ten opzichte van de meest recente en dezelfde voorouder. De genomen van de muis en de mens bevatten gelijke genen, en vaak liggen deze genen in gelijke volgorde. Afgezien van het verschil in uiterlijk tussen de muis en de mens, zijn er nog twee andere grote verschillen. Het eerste verschil is dat mensen drie kleuren kunnen zien en een muis ‘maar’ twee, en het tweede verschil is. dat muizen een veel beter reukvermogen hebben. Bij mensen zitten in het olfactorische systeem veel pseudogenen die inactief zijn. Er worden vergelijkingen gemaakt tussen de chimpansee en de mens, deze twee hebben een hele recente voorouder en lijken zeer veel op elkaar.

Sinds de mens vertrokken is uit Afrika zijn er vele soorten mensen ontstaan, maar hun genomen zijn voor 99,9% hetzelfde. De genen die verschillen liggen aan de adaptatie die elke soort heeft moeten ondergaan om te overleven. Ook tussen individuen zit er weinig verschil, maar de genen verschillen niet in een enkele base in 1000 basen. Ze verschillen door het aantal ‘copy number variations’ (CNV). Dit komt door duplicatie of deletie in het genoom.

Wetenschappers weten hoe coderende genen werken, maar niet hoe de non coderende genen, de introns, werken. Daar wordt op dit moment aan gewerkt door middel van behouden genen. Deze genen zitten al heel lang in het genoom. Ultrabehouden genen zijn genen die tussen verschillende soorten (mensen, muizen en ratten) hetzelfde zijn gebleven. Wetenschappers kunnen de mogelijke rol in genregulatie van behouden genen bepalen door middel van transcriptionele cis werkende en regulerende elementen. Een wetenschapper plaatst een mogelijk regulerend gebied, gelijk aan een promoter en reporteer gen, in een gastheercel. Als er een ander fenotype uitkomt dan eigenlijk de bedoeling is, is het waarschijnlijk een coderend gen.

15.6 Functionele genomica en omgekeerde genetica

Functionele genomica bestudeert de functie, expressie en interactie van genen. Er zijn nog verschillende soorten van functionele genomica: 1) transcriptoom kijkt naar de sequentie en expressie patronen van alle transcripten, 2) proteoom kijkt naar de sequentie en expressie patronen van alle eiwitten en 3) interactoom kijkt naar de complete set van fysieke interactie tussen eiwitten en DNA segmenten, tussen eiwitten en RNA segmenten en tussen eiwitten zelf.

Om het transcriptoom te bestuderen, wordt er gebruik gemaakt van DNA microarrays. Deze methode beantwoord de vraag ‘Welke genen zijn actief in een bepaalde cel onder bepaalde omstandigheden?’ Het bestaat uit de volgende stappen:

1. Extractie van mRNA van cellen of weefsel;

2. Synthese van het fluorescerende label de cDNA probes;

3. Hybridisatie, vergelijken, van de micro array (het beeld met alle stipjes). De controle groep is een gekozen RNA dat de normale stand van zaken representeert.

4. Detectie van het fluorescerende signaal van de probes door middel van een laser;

5. Vergelijk de relatieve levels van de probes. Kijk waar het ene DNA meer of minder voorkomt dan het andere DNA.

Bekijk figuur 15-19 op bladzijde 353 om deze methode extra te begrijpen.

Om te kijken of twee eiwitten interactie vertonen, kan de twee-hybride test gebruikt worden (figuur 15-21 op bladzijde 536). De basis voor deze test ligt bij de transcriptionele activator GAL4 bij gist. Dit eiwit bevat twee domeinen: 1) DNA bindingsdomein dat bindt aan de transcriptionele start plaats en 2) een activatie domein dat de transcriptie activeert, maar dat zichzelf niet kan binden aan het DNA. Deze domeinen moeten dus dicht bij elkaar zijn om te werken. Om te testen of ze communiceren kan je deze twee domeinen in twee verschillende eiwitten stoppen. Als deze eiwitten communiceren, zal de transcriptie beginnen.

Om te kijken of een eiwit met DNA communiceert kan er gebruikt worden gemaakt van de ‘chromatin immunoprecipitation assay’ (ChIP). Deze methode isoleert DNA en zijn eiwitten in een specifiek gebied van de chromatine, zodat beide geanalyseerd kunnen worden. Ook deze methode is te beschrijven in een aantal stappen:

1. Bepaal de eiwitten die bij een bepaald DNA horen (cross-link). Door verhitting blijft het eiwit bij het DNA, ook al wordt de chromatine open gebroken.

2. Breek de chromatine in kleine stukjes.

3. Voeg een antilichaam toe om het eiwit van belang te vinden en te zuiveren van al het andere DNA.

4. Haal de cross linkage weer uit elkaar zodat het eiwit apart van het DNA komt.

Systeem biologie kijkt naar alle gebieden in de biologie en voegt deze samen om het hele systeem te begrijpen.

Een krachtigere manier dan bovenstaande methodes is de omgekeerde genetica. Deze methode verstoord een gen en kijkt vervolgens wat er mis gaat. Omgekeerde genetica bevat drie verschillende onderdelen:

• Random mutagenesis zorgt ervoor dat random mutaties in het genoom gebracht worden. Dit kan op twee manieren: 1) focussen op de locatie van het gen waarna de mutatie op dat locus zijn werk kan doen en 2) simpelweg kijken of er mutaties in een bepaalde cel zitten. Deze methode duurt lang, maar geeft een prima effect.

• Gerichte mutagenesis maakt mutaties in bepaalde genen. Deze methode kost veel moeite, maar geeft een goede uitkomst.

• Fenokopieën kijkt naar effecten van mogelijke mutanten. Deze methode is efficiënt en handig voor bibliotheken.

16. Het dynamische genoom: wegwerp elementen

Gentherapie is een techniek om een kapot gen te vervangen door een werkend gen, waardoor er bijvoorbeeld een ziekte bestreden kan worden. Retrotransposons zijn genetische elementen die zich kunnen versterken in een genoom en veel voorkomen in het DNA van vele eukaryote organismen.

Dit hoofdstuk zal gaan over wegwerp elementen. Dit zijn elementen die bijna de helft van onze chromosomen innemen. Ze kunnen zich verplaatsen binnen een chromosoom, maar ook naar een ander chromosoom gaan.

16.1 Ontdekking van de wegwerpelementen in maïs

Barbara McClintock vond op chromosoom 9 dat er regelmatig een breking was. Ze noemde dit gedeelte Ds voor dissociatie. Er was ook een factor nodig dat voor deze breking zorgde en dat noemde ze de activator (Ac). Ze dacht dat dit mobiele elementen waren, aangezien ze de locatie van Ac niet in kaart kon brengen. Bij dezelfde lijnen kwam deze factor op verschillende plaatsen voor. Een breking op de Ds kan op verschillende plaatsen gebeuren. Het fenotype verandert omdat er recessieve genen naar boven kunnen komen, dit is omdat de dominante genen verwijderd zijn. Wanneer er een mixje optreedt, waarbij de Ds een deel van de genen die coderen voor uiterlijk weghaalt en ergens anders plaatst, heet dit een onstabiel fenotype.

Pigmentvlekken worden veroorzaakt door het aanwezig zijn van een Ds-gen en/of een Ac-gen. Het wilde type geeft het normale uiterlijk, het Ds-gen veroorzaakt een inactivatie van het wilde type gen en het Ac-gen geeft met en zonder het Ds-gen pigmentvlekken. Ds is naar alle waarschijnlijkheid een incompleet en gemuteerde versie van Ac. Er zijn ook andere systemen gevonden met zulke taken, bijvoorbeeld de suppressor/mutator (Spm). Om deze systemen te classificeren zijn er twee klassen: 1) autonome elementen die geen andere elementen nodig hebben om te werken (Ac) en 2) nonautonome elementen zijn het tegenovergestelde (Ds).

Eerst dacht men dat deze wegwerpelementen alleen in maïs voorkwamen, aangezien dit een bewerkt gewas is voor de mens. Later bleek dit in de E. Coli te zitten. En nog later bleek dat deze elementen waarschijnlijk in bijna elk organisme zitten.

16.2 Wegwerpelementen in prokaryoten

Er zijn twee brede typen wegwerpelementen in prokaryoten: 1) IS elementen die alleen genen bevatten voor de mogelijkheid om te bewegen en 2) transposons die niet alleen genen bevatten voor beweging, maar ook andere genen. De ‘insertion-sequence’ (IS) elementen kunnen naar een andere plek op hetzelfde chromosoom of naar een ander chromosoom gaan. Als de IS-genen in het midden van een gen terecht komen, kan dit de genexpressie verstoren. De IS elementen bevatten verschillende genen, maar hebben sowieso het eiwit transporase om zich te kunnen verplaatsen.

De resistentiefactor (R) blijkt op een transposon (Tn) te liggen. Er zijn twee soorten bacteriële transposons: 1) samengestelde transposons en 2) simpele transposons. De samengestelde transposons bevatten twee IS elementen, maar dan allebei gespiegeld aan elkaar (inversie herhaling). Simpele transposons hebben ook een inversie herhaling, maar bevatten geen transporase en maken dit zelf aan als ze willen verplaatsen.

De transporase werkt bij het verwijderen van het gen uit het originele chromosoom en bij het invoegen in een chromosoom. Om de transpose te verwijderen uit het gen worden er twee mechanismen gebruikt: 1) replicatief en 2) conservatief (non-replicatief). Replicatief zorgt ervoor dat het transposon gekopieerd wordt en vervolgens in het nieuwe chromosoom terecht komt. De conservatieve manier is dat het chromosoom zijn transposon afstaat en op een andere plaats terecht komt. De replicatieve transpositie is wat ingewikkeld. Tijdens transpositie, zijn de donor en de ontvanger plasmiden tijdelijk samengesmolten tot een dubbele plasmide. De vorming van dit tussenproduct wordt gekatalyseerd door TN3 transporase. Deze knipt de enkele streng op de twee uiteinden van TN3 en knipt gespreid op de doelsequentie. Vervolgens worden de twee vrije uiteinden aan elkaar geplakt waardoor een gefuseerde cirkel ontstaat dat het cointegraat wordt genoemd. Het transposon wordt gedupliceerd in het fusie evenement. Het cointegraat verandert in twee kleinere cirkel door middel van een soort recombinatie. Hierdoor ontstaat er een kopie van het transposon in elke plasmide. Het resultaat is dat een origineel exemplaar op de oorspronkelijke locatie blijft, terwijl de andere wordt geïntegreerd op een nieuwe positie. Voor insertie zie figuur 16-10 op bladzijde 554.

16.3 Wegwerpelementen bij eukaryoten

Bij eukaryoten zijn er twee soorten wegwerpelementen: 1) retrotransposons en 2) DNA transposons. Er zijn in gist pseudorevertanten gevonden die van de gemuteerde versie weer terug gingen naar het fenotypen. Dit werd vaak gevonden, waardoor er een vergelijking werd gemaakt met de bovenstaande wegwerpelementen van prokaryoten. Maar ze waren zeer anders dan de elementen van prokaryoten, aangezien het retrovirussen waren. Een retrovirus is een enkelstrengs RNA virus dat een dubbelstrengs DNA stuk gebruikt voor replicatie. Dit gaat op de volgende manier. Het retrovirus dringt de gastheercel binnen. Het RNA dat in het virus zit, maakt een complementair stuk DNA. Hierna komt er een DNA stuk van het oorspronkelijke RNA. Dit wordt gedaan door het enzym omgekeerde transcriptase. Het dubbel strengs DNA, provirus, op dit moment voegt zichzelf in het chromosoom van de gastheercel. Vervolgens wordt er mRNA geproduceerd samen met nieuwe virussen. De retrotransposons worden ook aangeduid als klasse 1 wegwerpelementen. De ‘long term repeat’ (LTR) omvat de genen van belang van de retrovirus en het ty1. Als wegwerpelementen dit bevatten, worden het LTR-retrotransposons genoemd. De copia elementen van de fruitvlieg lijken op de Ty1. Solo LTR zijn enkelstrengs LTR kopieën.

De klasse 2 wegwerpelementen zijn DNA transposons. Dit zijn de eerste wegwerpelementen ontdekt door McClintock. De eerste DNA transposons op moleculair niveau waren de P elementen bij de fruitvlieg. Het P-element produceert met de genen die die heeft transporase om zich te kunnen verplaatsen. De P-elementen zijn ontdekt door Margaret Kidweel wanneer ze hybride dysgenesis (vrouwen gekweekt door het lab kunnen geen kindjes maken) bestudeerde. De labsoorten bevatten een M cytotype (celtype) en de wilde types een P cytotype. Het P element is niet te vinden in M-cellen. Wetenschappers denken dat P elementen in P-cellen worden stilgelegd waardoor er geen transporase meer wordt gemaakt.

Een mogelijkheid waarom labvliegjes de P elementen bevatten, is doordat deze een lange tijd geleden door Morgan zijn gebruikt en ondertussen de P elementen genoeg transporase hebben kunnen maken en zichzelf dus hebben verplaatst.

De eerste bekende transposons in maïs zijn DNA transposons die structureel lijken op DNA transposons in bacteriën en andere eukaryoten. DNA transposons coderen voor een transporase dat het transposon snijdt van het chromosoom en katalyseert de reïntegratie bij andere chromosomale locaties. Elk familie van Ac en Dc heeft zijn eigen transporase.

P elementen kunnen gebruikt worden voor het taggen van genen die gekloond moeten worden. P elementen verstoren random genen waardoor er vreemde fenotypen kunnen ontstaan. Deze vreemde fenotypen kunnen gekloond worden, omdat het gen bekend is en daar het P element in zit. Dit wordt transposon tagging genoemd. Ook kunnen P elementen gebruikt worden voor het inbrengen van genen. Dit is uitgevonden door Rubin en Spradling waarbij genen van een donorvlieg in de kiembaan van een ontvangende vlieg terecht komt.

16.4 Het dynamische genoom: meer wegwerpelementen dan ooit gedacht

De C-waarde is de DNA inhoud van een organisme. De C-waarde paradox stelt dat de correlatie tussen de grootte van het genoom, niet correleert met de biologische complexiteit. Salamanders hebben bijvoorbeeld een genoom dat 20x groter is dan het humane genoom. Er is maar een klein gedeelte in het genoom dat genen bevat in multicellulaire organismen. De genoom grootte hangt meer af van de hoeveelheid wegwerpelementen dan van geninhoud.

De helft van het humane genoom bestaat uit wegwerpelementen en deze bestaan grotendeels uit twee groepen: LINE’s en SINE’s. LINE (long interspersed elements; voorbeeld is alu) bewegen als een retrotransposon, maar missen retrovirus elementen (bijvoorbeeld LTR). SINE (short interspersed elements) zijn nonautonome LINE’s, maar coderen niet voor omgekeerde transcriptase.

Planten overleven met zoveel invoeging van DNA doordat de informatie in introns wordt gevoegd, waardoor dit niet vertaald wordt en omdat het mobiele DNA vaak inactief is en niet kan beweging. Invoeging bij exonen heet negatieve selectie. Het mobiele DNA dat actief blijft, kan ziekten veroorzaken.

Syntenie is de geninhoud en -organisatie. Gelijke soorten kunnen erg in hun genoom verschillen, aangezien ze verschillen in het aantal LTR. Hoe groter het genoom, hoe meer LTR. Om het genoom van een gastheercel niet kapot te maken, wordt er gebruik gemaakt van veilige havens waarin wegwerpelementen hun DNA kwijt kunnen. Deze veilige havens zijn andere retrotransposons, heterochromatine of centromeren waar weinig genen zijn en veel herhalend DNA.

Wanneer er een gebied is waar weinig veilige havens zijn, injecteren de wegwerpelementen in bepaalde sequenties. Dit wordt targeting genoemd.

16.5 Epigenetische regulatie van wegwerpelementen van de gastheercel

Eukaryotische gastheercellen gebruiken RNAi om de expressie van actieve transposons in hun genoom te onderdrukken. Zo kan een enkel element dat zich bij een gen voegt, worden gekopieerd om dsRNA te produceren. Het dsRNA legt het zwijgen op alle kopieën van dat element in het hele genoom.

MITE (miniature inverted repeat transposable element) zijn geen autonome DNA transposons dat veel in het genoom gekopieerd kan worden. Terwijl MITE's de transporase van autonome elementen gebruiken, leggen ze de gastheercel het zwijgen niet op, omdat hun amplificatie niet leidt tot het zwijgen van de transporasegen.

17. Mutatie, herstel en recombinatie

Individuen die een fenotype laten zien dat anders is dan de meeste mensen, heten varianten. Deze varianten ontstaan door onder andere mutatie en recombinatie. Recombinantie en DNA herstel hebben een aantal punten gemeen. In dit hoofdstuk zullen die punten besproken worden. Vervolgens zal het gaan over genmutatie: veranderingen van baseparen binnen in een gen.

17.1 De fenotypische consequenties van DNA mutaties

Een puntmutatie is een mutatie dat een enkel of een klein aantal basenparen betrekt. Een punt mutatie kan op de volgende manieren voorkomen:

• Base vervangen

  • Transitie zorgt ervoor dat een base wordt vervangen door een base met dezelfde chemische categorie. Een pyrimidine wordt vervangen door een pyrimidine (C door T of andersom). Dit geldt hetzelfde voor purine’s.

  • Transversie is wanneer een base wordt vervangen door een base uit een andere chemische categorie.

• Base toevoeging of een base deletie (indel mutaties)

Wanneer een puntmutatie ontstaat, kunnen er de volgende consequenties ontstaan:

• Synonieme mutaties veranderen een codon in een codon die voor hetzelfde aminozuur codeert. Dit zijn stille mutaties.

• Missense mutaties veranderen een codon in een codon dat voor een ander aminozuur codeert.

• Nonsense mutaties veranderen een codon in een stopcodon.

Wanneer een missense mutatie een aminozuur vervangt door een chemisch gelijk aminozuur, heet dat een conservatieve vervanging. Dit is geen ernstige consequentie. Een nonconservatieve vervanging, een aminozuur wordt vervangen door een heel andere soort aminozuur, kan ergere consequenties met zich mee brengen. Het DNA dat gelezen wordt, het leeskader, verandert door indel mutaties. Deze mutaties heten frameshift mutaties. Hierbij wordt de volgorde waarin de triplets moeten worden gelezen, verstoord doordat er duplicaties of deleties zijn.

Mutaties in een niet coderende regio zijn anders dan bovenstaande mutaties in wel coderende regio’s. In de niet coderende regio’s zitten alle bindingsplaatsen en meer eigenschappen die cruciaal zijn voor transcriptie en translatie. Puntmutaties in coderende gebieden kunnen de eiwit structuur veranderen zonder dat het mRNA verandert. Ook kunnen ze in regulerende regio’s het produceren van mRNA en eiwitten blokkeren. Daarnaast verandert hier de structuur van het eiwit niet, maar de hoeveelheid van dat eiwit.

17.2 De moleculaire basis van spontane mutaties

Er zijn spontane mutaties die zomaar optreden. Er zijn ook veroorzaakte mutaties die door mutagenen veroorzaakt zijn.

Luria en Delbrück hebben de fluctuatie test uitgevoerd. Zij kwamen erachter dat mutaties random in de tijd voorkwamen, maar eerdere mutaties beter konden overleven aangezien zij langer de tijd hebben gehad om resistente cellen op te bouwen. De test replica plating van Lederberg en Lederberg heeft aangetoond dat mutaties random optreden en vaak niet door een mutagen. Ze lieten kolonies groeien op platen en vervolgens hebben ze deze kolonies op een andere plaat met fagen gestempeld. Hier overleefden kolonies die op dezelfde plek lagen als de eerste plaat. De mutaties hadden al plaatsgevonden, voordat een mutagen in de buurt kwam.

Oorzaken van spontane mutaties zijn fouten tijdens de replicatie of spontane laesies. De fouten tijdens replicatie kunnen voorkomen doordat transities niet worden verbeterd tijdens proofreading, transversies komen ook voor door misplaatsing en frameshift mutaties door indel mutaties, aangezien deze de triplets verzieken. Spontane laesies ontstaan door depurinatie of deaminatie. Depurinatie houdt een verlies van een purine in. Hierbij bindt de suikergroep niet meer aan de base. Hierdoor ontstaan er apurinic plaatsen, maar dit wordt door een mechanisme opgelost wat later aan bod komt. Tijdens deaminatie verliest de cytosyne zijn NH₃-groep en komt er een H₂O groep voor in de plaats. Hierdoor ontstaat er een uracil groep. Zuurstofschade aan moleculen kan ook leiden tot mutaties.

Sommige ziektes ontstaan doordat er duplicaties ontstaan van korte herhalende sequenties (trinucleotide-herhaling). Het fragiele X-syndroom is zo’n ziekte en veroorzaakt mentale verslechtering. De (groot)ouders van de nakomelingen bevatten premutaties die instabiel zijn en vervolgens muteren bij nakomelingen. Als er meer dan 50 herhalingen zitten, dan is er een drempelwaarde bereikt en kan het replicatiesysteem niet goed meer functioneren. Huntington en Kennedy zijn ook ziektes die veroorzaakt worden door een trinucleotide-herhaling. Er zit een patroon in dit soort ziekten, aangezien ze allemaal het zenuwstelsel aantasten en vaak in het coderende gebied van het gen zitten.

17.3 De moleculaire basis van veroorzaakte mutaties

Mutagenen beïnvloeden mutaties op drie verschillende manieren:

• Ze kunnen basen vervangen in het DNA. De basen worden vervangen door base analogen die op basen lijken, maar niet goed zijn voor de replicatie.

• Ze kunnen ervoor zorgen dat een base niet aan zijn eigen base komt te zitten. Dit wordt gedaan door bepaalde agenten. EMS plakt ethylgroepen aan de basen en NG plakt methylgroepen aan de basen. Tussenvoegende agenten kunnen zich als een basepaar voordoen waardoor er een deletie optreedt.

• Ze kunnen basen beschadigen zodat deze niet meer kunnen binden. Dit kan door meerdere factoren veroorzaakt worden. UV-licht zorgt ervoor dat twee purine basen aan elkaar binden. Dit worden fotoproducten genoemd. Ioniserende bestraling beschadigd de water- en zuurstofverbindingen in de basen.

De Ames test kijkt naar chemische samenstellingen die een risico zijn voor de gezondheid en omgeving.

17.4 Biologische herstel mechanismen

DNA is het enige wat organismen hersteld in plaats van vervangt. Een herstelmechanisme is bijvoorbeeld proofreading. Vele ziektes en syndromen worden veroorzaakt door onherstelbare beschadigingen aan het DNA. Een ander mechanisme is fotoreactivatie. Hier worden fotoproducten hersteld door het enzym CPD fotolyase. Het enzym verbreekt de binding tussen de basen en zorgt dat ze weer normaal binden zoals ze dat moeten doen. Alkyltransferases breken verbindingen van methyl of ethyl groepen aan basen. Dit zijn directe herstel mechanismen van beschadigd DNA.

Een ander herstel mechanisme is om base-excisie. Dit mechanisme is gebaseerd op het feit dat basen complementaire basen hebben (homoloog afhankelijk herstel mechanisme). In base-excisie herstel, is niet omvangrijk schade aan het DNA herkend door een van de verschillende enzymen genaamd DNA glycosylases. Omvangrijke schade wordt veroorzaakt door methylatie, deaminatie, oxidatie en spontaan verlies van basen. De glycosylase splitst de base-suiker binding. Vervolgens wordt de foute base losgelaten. Reparatie bestaat uit het verwijderen van de foute base en de insertie van de correcte base door middel van het homoloog afhankelijk herstel mechanisme.

Nucleotide-excisie herstel zorgt ervoor dat blokkeringen in de transcriptie of translatie opgeheft en hersteld worden. Xeroderma pigmentosum (XP) en Cockayne syndroom worden allebei veroorzaakt door een defect in het nucleotide-excisie mechanisme. Daarnaast zijn mensen met deze syndromen zeer gevoelig voor UV-licht. Het nucleotide-excisie systeem is een ingewikkeld systeem, maar kan uitgelegd worden in vier stappen:

1. Herkenning van de beschadigde basen. Dit kan op twee manieren: door middel van 1) ‘transcription-coupled nucleotide-excision repair’ (TC-NER) en 2) ‘global genomic repair’ (GGR). Nummer 1 controleert DNA en nummer 2 controleert het hele genoom en zit vaak bij de replicatievork.

2. Montage van een multi-eiwit aan de bindingsplaats.

3. De beschadigde streng wordt beide kanten op geknipt, waarna de nucleotides worden verwijderd tussen de knipplaatsen.

4. Gebruik maken van de onbeschadigde streng als template voor het aanplakken van nieuwe basen.

Voor extra duidelijkheid zie figuur 17-22 op bladzijde 595. Heterogene genetische ziekten zijn ziekten waarbij mensen meerdere beschadigingen hebben op factoren die een rol spelen bij de ziekte.

Een postreplicatie herstel systeem is het mismatch herstel systeem. Dit systeem gaat nog een stapje verder dan proofreading. Mismatch herstel moet voldoen aan drie punten: 1) het herkennen van mismatched basenparen, 2) bepalen welke base de verkeerde base is en 3) de foute basen eruit knippen en de goede base er invoegen. Het is een oud systeem, aangezien het in vele soorten organismen, zoals bacteriën, gist en mensen, voorkomt. Enzymen die hierbij belangrijk zijn, zijn MutS (fout herkennen), MutL, MutH (knipt de streng met de foute base) en UvrD. Bij prokaryoten wordt de foute base herkend doordat het methyliseren van adenine even duurt. Hierdoor knipt MutH de nog niet gemethyliseerde adenine en vervolgens zoekt UvrD het foute basenpaar. Een defect in dit systeem zorgt voor HNPCC dat een verhoogde kans op kanker geeft.

Een ander herstel systeem zijn translaesie DNA syntheses. Bij E. Coli zorgt het SOS systeem ervoor dat er geen celdood optreedt wanneer een replicatievork geblokkeerd is. De translaesie bij eukaryoten gaat als volgt. Polymerase 3 komt aan bij de beschadiging en blijft daar zitten. Het RecA enzym bindt aan het enkelstrengs DNA. De bypass polymerase vervangt polymerase 3 en continueert de DNA synthese. De bypass polymerase valt ervan af, wordt vervangen door polymerase 3 die de synthese vervolgens afmaakt.

De bypass polymerase verschilt in drie opzichten van ‘gewoon’ polymerase: 1) ze kunnen meer hebben, 2) kunnen meer fouten maken en 3) kunnen maar een paar nucleotide toevoegen voordat ze er afvallen.

Bovenstaande mechanismen kunnen niet worden gebruikt wanneer beide strengen van het DNA beschadigd zijn. De oorzaak is dat er geen template strengen gebruikt kunnen worden voor herstel. Als dit niet wordt hersteld, kunnen er prekanker cellen of celdood ontstaan. Twee herstelmechanismen zijn ‘nonhomologous end joining’ (NHEJ) en homologe recombinatie. NHEJ wordt uitgevoerd door twee eiwitten, KU70 en KU80, die aan beide uiteinden binden. Deze zorgen ervoor dat er geen verder verlies van DNA plaatsvindt en dat ligase aangetrokken wordt om de uiteindes aan elkaar te plakken. De identificatie van genen die verantwoordelijk zijn voor genetische ziektes is een belangrijke manier die gebruikt wordt om onbekende componenten van herstel en andere biologische mechanismen te isoleren. ‘Synthesis-dependent strand annealing’ (SDSA) is een vorm van homologe recombinatie. Het is een mechanisme dat niet op zoek gaat naar een fout (error-free), maar het repareert dubbel strengse breuken in delende cellen. Hier dient een zuster chromatide als matrijs voor reparatie synthese.

Dubbel strengse breuken initiëren recombinantie tijdens meiose. Dit wordt gedaan door het enzym Spo11. De breuken treden op in de chromosomen nadat ze zijn gekopieerd, maar voordat de homologen scheiden.

17.5 Kanker: een belangrijke, fenotypische consequentie van een mutatie

Kanker zorgt ervoor dat cellen extra gaan delen, geen celdood meer zullen activeren (apoptosis) of het aantal mutaties zal toenemen. Kanker wordt veroorzaakt doordat één cel zichzelf heel vaak gaat klonen. De cel zelf werkt prima, maar er zijn er teveel van die van alles veroorzaken.

Mutaties in kankercellen is op genniveau. UV-licht en bestralingen zorgen ervoor dat mutaties optreden waardoor cellen gaan groeien en er zijn aanwijzingen in genentaal voor verschillende kankersoorten. Oncogene mutaties zijn dominant en de eiwitten die hierdoor geproduceerd zijn, zijn meestal actief. De mutatie hoeft maar in één allel voor te komen. Anders heet het een proto-oncogen. Tumor-suppressor genen zijn recessief en coderen voor eiwitten waarvan de activiteit verloren is die vervolgens zorgen voor kankercellen. Het eiwit dat continu wordt geproduceerd door het oncogen, wordt een onco-eiwit genoemd.

18. Populatie genetica

Een populatie is een groep individuen die tot dezelfde soort behoren. Populatie genetica analyseert de hoeveelheid en verdeling van genetische variatie bij populaties en hoe deze variatie gecontroleerd wordt. Belangrijke onderdelen bij de populatie genetica is de wereldwijde voedselcrisis, de verdeling van de eerste mensen in Afrika naar de rest van de wereld en de recherche die boeven oppakt.

18.1 Genetische variatie detecteren

Tegenwoordig worden er meerdere genen gebruikt om populatie genetica uit te voeren, door middel van verbeterde technologieën. Vroeger werd er vaak maar naar één gen gekeken. Een gen ligt op een locus en kan één of meerdere basen betrekken. De simpelste vorm van variatie is waar een andere base ligt dan ‘normaal’. Dit worden ‘single nucleotide polymorphisms’ (SNP) genoemd. Ook maken wetenschappers gebruik van microsatelliet loci. Dit zijn loci met herhalende sequenties van twee tot zes basenparen. Algemene SNP’s komen het meeste voor en de zeldzame SNP’s komen minder dan 5% voor. De SNP’s zijn in drie groepen te verdelen: 1) synonieme SNP’s die voor hetzelfde aminozuur coderen, 2) nonsynonieme SNP’s die voor een ander aminozuur coderen en 3) nonsens SNP’s waarbij één allel codeert voor een stopcodon en het andere allel voor een aminozuur.

SNP’s worden ontdekt door gebruik te maken van een ontdekkingspanel van individuen die geanalyseerd worden. Vervolgens worden de genotypen voor elke populatie bepaald. Vaak wordt hierbij gebruik gemaakt van micro array.

Microsatellieten zijn anders dan SNP’s omdat ze groter zijn, een hogere mutatie variatie hebben en ze komen veel meer voor. Ze komen overal voor in het genoom en worden vaak gevonden door naar hun genoom te kijken (modelorganismen) of om een bibliotheek te maken (non-model organismen). Vervolgens worden de loci met PCR geamplificeerd en verwerkt.

Haplotypes zijn loci die gelinked zijn als groep. Homologe chromosoom loci bevatten dezelfde allelen. Ze worden vaak gebruikt bij populatie genetica als de loci dicht bij elkaar liggen. Het haplotype netwerk laat de relatie zien tussen de haplotypes. Deze loci worden ook gebruikt om te kijken waar de mutatie is begonnen, en dus waar de stercluster ligt. Dit is de plaats op de wereld waar de meeste mutaties zijn.

Er kan ook variatie optreden door indel polymorfismen of gevonden worden in mitochondriaal- en chloroplast DNA.

De HapMap is een wereldwijde creatie dat de haplotypes in kaart brengt. Hierbij zijn er duizenden individuen geanalyseerd.

18.2 Het genpoel concept en de Hardy-Weinberg wet

Het genpoel concept houdt de som in van alle allelen in bij de leden van een populatie op een gegeven moment. Het genotype frequentie is het aantal allelen van belang uit de populatie gedeeld door het totaal aantal allelen uit de populatie. Voor wetenschappers is het handiger om allel frequenties te gebruiken. Hier wordt er gekeken uit hoeveel allelen er zoveel dominant of recessief zijn. Hier horen de letters p (A) en q (a) bij. Het bereken van p en q gebeurt met behulp van de volgende formules:

Formule 1 (zie bijlage)

Hierdoor zijn de volgende formules van toepassing:

p + q = f_A/A + f_A/a + f_a/a = 1,0 en q = 1 – p

De Hardy-Weinberg wet gaat over de berekeningen waarbij je een bepaald allel met een bijbehorende frequentie uit een genpoel trekt. De berekeningen die hierbij horen, waarbij de kansen op het trekken van A of a worden weergegeven door p en q, zijn als volgt:

f_A/A = p², f_A/a = 2pq en f_a/a = q² en dus p² + q² + 2pq = 1,0

De allelfrequenties kunnen ook uitgerekend worden, als bekend is in welke mate een bepaald allel voorkomt (bijvoorbeeld 1 op de 1100). De formules zijn als volgt:

Formule 2 (zie bijlage)

Als er gebruik gemaakt wordt van de Hardy-Weinberg wet, dan moeten er aannames worden gewaarborgd. De steekproef die gebruikt wordt, moet random getrokken zijn. Alle genotypen moeten mee genomen worden, dus ook wanneer een allelcombinatie dodelijk is. Daarnaast moet de populatie niet al geïsoleerd zijn in een subgroep. Als laatste moeten er grote steekproeven gebruikt worden.

Met de Hardy-Weinberg wet kan er bepaald worden wat de frequenties zijn van de volgende generaties. Wanneer in grote populaties de genetische variatie niet gecreëerd noch vernietigd wordt door het proces van genenovererving naar de volgende generatie, dan is het Hardy-Weinberg equilibrium bereikt.

Als er meer dan twee allelen gebruikt worden, is het ook mogelijk om de Hardy-Weinberg wet toe te passen. De homozygoten zijn de frequentie van het aantal AA of aa in de populatie gedeeld door het totaal in het kwadraat. De heterozygoten zijn de wortels uit de homozygoten frequenties. De Hardy-Weinberg wet kan ook gebruikt worden bij gekoppelde allelen en Chi-kwadraat testen.

18.3 Parings systemen

De Hardy-Weinberg wet verwacht random paringen, maar hier kan bias in komen. Een paringssysteem dat hiervoor zorgt, is assortatief paren. Dit houdt in dat individuen een paringsmaatje zoeken die er hetzelfde uitziet als zichzelf. Positief assortatief paren is wanneer individuen dezelfde eigenschappen zoeken in een paringsmaatje. Negatief assortatief paren (disassortatief paren) is wanneer individuen andere eigenschappen zoeken in een paringsmaatje. Een ander paringssysteem is isolatie door afstand. Hier kunnen individuen niet met elkaar paren, aangezien ze elkaar niet tegenkomen. Hierdoor kunnen er specifieke eigenschappen ontstaan voor een speciaal gebied (populatie structuur). Als dit het geval is, zijn er meer homozygoten dan dat de Hardy-Weinberg wet verwacht. Ook is inteelt een paringssysteem dat het random paren tegen gaat. Deze nakomelingen hebben sneller kans op bepaalde syndromen. Inteelt depressie houdt in dat er meer kans is op deleties door fatale homozygote allelen combinaties waardoor er stoornissen kunnen ontstaan. Bij planten is inteelt vaak positief.

De mate waarin inteelt depressie voorkomt, hangt af van de frequentie van deleties en de inteelt coëfficiënt. Deze laatste houdt de kans in dat twee allelen in een individu terug gaan naar een allelcombinatie van een voorouder. Als een halfzus en een halfbroer een kind krijgen en genen doorgeven, waardoor het kind dezelfde genen heeft als zijn of haar oma/opa, dan heet dat identical by descent (IBD). IBD wordt aangegeven door het symbool ‘~’. De algemene formule voor het berekenen van de inteelt coëfficiënt is:

Formule 3 (zie bijlage)

Waarbij n het aantal individuen van belang in de stamboom zijn.

De kans op inteelt is groter bij kleinere groepen. Het begint allemaal bij een individu t met een ander individu (t + 1). De kans op datzelfde allel is N, waarbij N de grootte is van de populatie. Het level van inteelt, dat rekening houdt met twee mogelijke allelkeuzes, is te berekenen met behulp van de volgende formule:

Formule 4 (zie bijlage)

Zie box 18-3 op bladzijde 626 voor een toepassing van deze formule. Hoe groter N, hoe kleiner de kans op F wordt.

18.4 Genetische variatie en zijn metingen

Om variatie te kwantificeren, kan er gebruikt gemaakt worden van segregatie plaatsen (S). Hierbij wordt er gekeken of de groep van belang en de controlegroep verschillende hoeveelheden qua segregatie plaatsen hebben. Een andere simpele meting is het aantal haplotypes tellen. Het nadeel van deze twee metingen is dat ze afhangen van de steekproefgrootte. Hierdoor worden er allelfrequenties gebruikt, die onafhankelijk zijn van de steekproefgrootte. Deze worden berekend door de gen diversiteit (GD) methode met de volgende berekening:

Formule 5 (zie bijlage)

Als de frequenties van de allelen hoog zijn, dan zal hier de GD richting de 1 gaan en andersom. Deze formule is hetzelfde als de heterozygote formule van de Hardy-Weinberg wet, maar deze kan ook gekoppelde en diploïde berekeningen doen. Hierdoor wordt deze meer gebruikt. Als er wordt gekeken naar de verdeling van meerdere nucleotiden, heet dat nucleotide diversiteit.

18.5 De aanpassing van genetische variatie

De aanpassing van genetische variatie gaat over de genenpoel waarin allelen bijkomen of verdwijnen. Er kunnen nieuwe allelen in de populatie komen door mutatie en migratie. In de populatiegenetica zijn genetici geïnteresseerd in de kans dat een allel verandert in een ander allel binnen één generatie (mutatie snelheid, μ). Om dit te schatten wordt er gekeken naar een stamboom met meerdere generaties en mutaties, waarna berekeningen gedaan kunnen worden. Migratie, of genen stroom, is de beweging van individuelen tussen populaties. Genetische admixen zijn genen vanuit meerdere populaties met meerdere voorouders.

Recombinatie is een andere oorzaak voor genetische variatie. Deze zorgt voor nieuwe haplotypes. Bij gekoppelde genen moet er altijd een b of B gekozen worden. Deze kans is 0,50. Dit geldt hetzelfde voor a of A. Vervolgens kunnen de kansen berekend worden op allelen. Als er een gekoppeld equilibrium is, dan zullen de allelen op random manier en puur op kans gebaseerd koppelen. De kansen op P_AB, P_Ab, P_aB en P_ab zijn dan allemaal 0.25. Als de kansen niet 0,25 zijn, dan is er sprake van een gekoppeld disequilibrium. Als beide loci maar twee allelen hebben, dan is de formule als volgt:

D = P_AB – p_Ap_B

Als uit deze formule een antwoord hoger dan nul komt, dan is er sprake van gekoppelde disequilibrium (LD). D₀ is de LD van de eerste generatie en D₁ is de LD van de volgende generatie. Dit kan berekend worden door middel van de volgende formule:

D₁ = D₀(1 – r)

Hierbij is r de recombinatie frequentie. LD neemt af met de tijd, vanwege recombinatie.

Verandering in allelfrequenties tussen generaties door steekproef error, is random genetische drift. Er is sprake van random genetische drift als de allelfrequenties verschillen ten opzichte van de 0,5 ratio (p = q = 0,5). De kans dat een specifiek aantal kopieën van A getrokken wordt, kan berekent worden door middel van de volgende formule:

Formule 6 (zie bijlage)

Hierbij is k het aantal gewenste kopieën, N de populatie grootte en p en q de kansen op p en q. Het getal wat hieruit komt, geeft aan hoeveel A en a frequenties er hetzelfde zullen zijn met de vorige generatie. Hoe groter een populatie, hoe minder kans de mutatie heeft om in die populatie te blijven (). Dit geldt uiteraard hetzelfde voor een positieve mutatie. Deze kan, ook al heeft het een goede uitkomst op overleven, uit het genoom verdwijnen door meerdere redenen. Denk hierbij aan geen kinderen produceren, te snel dood of de slechte allelen vanwege kans doorgeven.

Wanneer allelen dezelfde overlevingskans en doorgeefkans hebben, worden ze neutrale allelen genoemd. Verandering bij de allelen door random genetische drift heet neutrale evolutie. Dit is de basis voor de moleculaire klok: constante snelheid van vervanging of nieuwe allelen varianties van al bestaande allelencombinaties. Wanneer random genetische drift veroorzaakt wordt door random steekproeftrekken van de originele populatie, om zo een nieuwe populatie te vormen, heet dat het founder effect. Een populatie grootte kan ook veranderen door verandering in een enkele omgeving. Denk hierbij aan omgevingsfluctuaties die zorgen voor minder oogst of meer jagen op populaties. Dit zijn populatie flessenhalzen. Het aantal leden neemt af, net zoals een fles ondersteboven dat van dik naar de dunne hals toe loopt. Hierdoor gaan er veel allelencombinaties verloren.

De bovenstaande genetische populatie veranderingen verklaren niet de adaptatie die organismen doormaken. Hier hoort uiteraard de evolutie theorie van Darwin bij die stelt dat organismen met bepaalde genen eerder overleven en nakomelingen produceren. De betere allelfrequenties nemen toe als de tijd verstrijkt en ze meer nakomelingen kunnen produceren met de geliefde allelen. Darwiniaanse fitness betreft de mogelijkheid om te overleven én nakomelingen te produceren. Het aantal nakomelingen werd door Darwin genoteerd en absolute fitness genoemd (W). De relatieve fitness (w) vergelijkt het aantal nakomelingen van een lid met het meest sterke lid uit de populatie met nakomelingen. Een heel mooie berekening, dat alles hierboven samenvat, staat op bladzijde 640.

Er zijn vier soorten natuurlijke selecties van Darwin:

• Richting selectie zorgt ervoor dat een allel op een gegeven moment vastzit in het genoom (fixed) of verloren gaat. Dit is de algemene natuurlijke selectie van Darwin. Deze kan weer onderverdeeld worden in de volgende twee:

  • Positieve selectie zorgt ervoor dat een allel van belang vaker voor zal komen in een populatie. Dit kan gedetecteerd worden door genetische diversiteit en LD.

  • Zuiverende (purifying) selectie verwijdert negatieve allelen uit de populatie. Ook zorgt het ervoor dat bestaande aanpassingen niet verloren gaan.

• Balancerende selectie houdt de allel A en a in evenwicht, wanneer deze samen het beste werken. De homozygote allelen worden liever niet toegepast.

• Kunstmatige selectie wordt veroorzaakt door de mensen zelf. Deze moduleren planten en gewassen voor een betere oogst, bijvoorbeeld.

Mutatie en drift zijn in balans (equilibrium), wanneer het verlies en het verkrijgen van variatie gelijk is. De formule die hierbij hoort, is:

Formule 7 (zie bijlage)

H is hier de mate van heterozygootheid dat verloren of verkregen wordt. Er kan ook een equilibrium optreden tussen mutatie (verkrijgen) en selectie (verliezen). De selectie coëfficiënt (s) is het gedeelte dat telkens verdwijnt in de populatie (bijvoorbeeld, een allelencombinatie aa is s – 1). De vergelijking voor een equilibrium frequentie van een recessieve deletie is:

Formule 8 (zie bijlage)

18.6 Biologische en sociale toepassingen

De biologie wordt toegepast op sociale onderwerpen zoals conservatieve genetica, het berekenen van ziekte risico’s, DNA forensisch onderzoek en het zoeken van DNA gelijken op Google. Conservatieve houdt uitstervende en kleine populaties ‘levend’ in bijvoorbeeld dierentuinen. Helaas is hierbij de kans op inteelt alleen groter door de flessenhals theorie. Het berekenen van ziekterisico’s wordt niet alleen gedaan door stambomen bestuderen, maar ook door populatie genetica. Voorbeelden van ziekten hierbij zijn Cystic Fibrosis en sikkelcelanemie. Bij forensisch onderzoek wordt DNA op een crime scene geamplificeerd door PCR. Vervolgens stelt de nulhypothese dat het DNA van iemand anders komt en dus niet van de verdachte. De microsatellieten worden gebruikt tijdens deze analyse.

19. De overerving van complexe karakteristieken

Kenmerken, zoals lengte, zijn continue variaties. Deze passen niet bij Mendels theorie (kwantitatieve kenmerken). Er zijn flinke discussies geweest over het feit dat Mendels theorie wel of niet continu kan zijn. Hier is een einde aangemaakt door de multifactoriële hypothese. Deze hypothese stelt dat continue kenmerken beheerst worden door een combinatie van Mendelse loci en omgevingsfactoren. Complexe eigenschappen zijn trekjes die worden bepaald door de genen en de omgeving. Hierdoor is de kwantitatieve genetica ontstaan. Het doel hiervan is om de genetische architectuur van complexe eigenschappen te bepalen.

19.1 Meten van kwantitatieve variatie

Een continue eigenschap kan elke waarde aannemen. Deze hebben vaak complexe overerving: meerdere genen en omgevingsfactoren beïnvloeden die waarde. Sommige kenmerken kunnen in categorische eigenschappen gestopt worden. Dit zijn discrete eigenschappen en kunnen niet elke waarde aannemen. Hierbij hoort de simpele overerving en gaat het vaak om wel of niet de ziekte hebben. Het hebben van type 2 diabetes is categorisch, maar de ziekte zelf is zeer ingewikkeld. Dit wordt dan een drempelwaarde eigenschap genoemd. Een meristische eigenschap kan een range discrete waardes, zoals 1, 2 en 3, bevatten. Deze zorgen vaak voor complexe overerving.

Genetici werken met mensen uit een populatie (mensen met dezelfde kenmerken). Er wordt een random (elke deelnemer heeft evenveel kans om gekozen te worden) steekproef getrokken, aangezien een populatie vaak te groot is. Het gemiddelde kan berekend worden van deze steekproef met de volgende formule: x̄ = Formule 9(zie bijlage)

Het gemiddelde van de populatie is wanneer data van elk persoon uit de populatie wordt verkregen. Het gemiddelde is handig om populaties te vergelijken met elkaar. Statistici hebben nog een andere definitie van het gemiddelde: het gemiddelde van een random variabele, X, is de verwachte waarde van die random variabele (E (X) = x̄).

De variantie kijkt naar de mate van verschil tussen individuen en het gemiddelde. Deze variantie kan weergegeven worden in een frequentie histogram. Hier wordt aangegeven hoeveel mensen binnen een bepaalde klasse vallen. De variantie kan berekend worden als de deviatie bekend is. Deze heeft de formule: x = X_i - x̄. Vervolgens moet de sum of squares berekend worden:

Formule 10(zie bijlage)

De steekproef variantie wordt aangegeven door s². Om deze te berekenen, moet de sum of squares gedeeld worden door n - 1. Hoe hoger de variantie, hoe groter de individuele waardes onderling verschillen. De variantie staat standaard in kwadraat. Ook kan de variatie variëren van nul tot oneindig en de variantie is gelijk aan de verwachte waarde van de gekwadrateerde deviatie. Om de standaarddeviatie te berekenen, wordt de volgende formule gebruikt: Formule 11 (zie bijlage)

De normaalverdeling kan gebruikt worden om kwantitatieve eigenschappen te beschrijven. Hierbij valt 68% binnen één standaard deviatie en 95,5% binnen twee standaard deviaties.

19.2 Een simpel genetisch model voor kwantitatieve eigenschappen

De waarde van een individu met genexpressie (g) en omgevingsfactoren (e) kan uitgedrukt worden met het gemiddelde (x̄): X = x̄+ g + e. Vervolgens kan er gekeken worden wat de effecten van de genen en de omgeving is met de versimpelde formule: x = g + e.

Een manier om genetische identieke individuen te creëren is door middel van inteeltkruisingen of zelfkruisingen bij planten.

De formule x = g + e kan ook gebruikt worden om de variantie beter te begrijpen. De formule wordt dan V_X = V_g + V_e. Deze formule laat covariantie zien: twee variabelen die samen invloed hebben op dezelfde eigenschap. Hierbij is het van belang om te weten dat de omgeving en genen onafhankelijke variabelen van elkaar zijn. Als ze wel gecorreleerd aan elkaar zijn, dan klopt de formule niet. Dan wordt de aanname van onafhankelijkheid geschonden.

Met scatterplots kan de correlatie bekeken worden. De correlatie coëfficiënt (r) kijkt in hoeverre twee variabelen verbonden zijn. Deze kan variëren van nul (lage correlatie) tot -1 en 1 (hoge correlatie). Hier hoort uiteraard een formule bij:

Formule 12 (zie bijlage)

19.3 Brede-zin overerving: nature versus nurture

De vraag bij nature versus nurture is in hoeverre elk onderdeel bijdraagt aan het vormen van een eigenschap van een individu. Het begrip brede-zin overerving (H²) is fenotypische variantie dat schuld heeft aan genetische verschillen tussen individuen. Dit is ook in een formule te zetten:

Formule 13 (zie bijlage)

Als alles te wijten is aan de omgeving, dan zal de H² nul zijn. Hoe hoger de H² is, hoe meer de genetische achtergrond een rol speelt bij een bepaalde eigenschap.

Om de genetische- en omgevingsachtergrond te meten, worden identieke tweelingen bestudeerd. Zij bevatten dezelfde genen maar niet altijd dezelfde omgeving. Denk bij het laatste puntje aan adoptie. De berekening die hierbij hoort, bekijkt de covariantie tussen identieke tweelingen die apart zijn opgegroeid, maar dezelfde genen hebben.

Formule 14 (zie bijlage)

Er zijn de laatste 100 jaar zeer veel studies gedaan met tweelingen. Hier is uitgekomen dat vele eigenschappen van ons al vastgelegd liggen in onze genen. Voorbeelden hiervan zijn intelligentie, psychiatrische stoornissen en fysieke eigenschappen. Hou bij dit soort metingen wel in gedachte dat H² afhangt van een bepaalde populatie of steekproef en dat dit daardoor zeer kan variëren tussen mensen of andere populaties. Ook worden baby’s niet random in een tehuis of gezin geplaatst. Daarnaast kunnen prenatale effecten ook invloed hebben op de baby’s. Als laatste is de H² niet verstandig om te gebruiken tussen populaties.

19.4 Korte-zin overerving: voorspelling van fenotypes

Korte-zin overerving is de ratio toegevoegde variantie : fenotype. De gen actie is de interactie tussen allelen op een locus. Deze actie is belangrijk voor korte-zin overerving. Toevoegende variantie (a) is wanneer de heterozygote waarde tussen de twee homozygote waarde ligt (rr is één, Rr is twee en RR is drie). Dominante variatie (d) is wanneer het dominante gen aanwezig is, homo- of heterozygoot, eenzelfde waarde aangeeft (rr is één, Rr is drie en RR is drie). Gedeeltelijk dominantie is als het heterozygote gen net niet de dominante waarde bereikt.

Wanneer drie planten, homozygoot dominant, gekruist worden, en de genen actie is volledig toevoegend en er zijn geen omgevingsfactoren, dan is het fenotype compleet te overerven. Bij dominante variatie is dit moeilijker, want je kan hetero- en homozygoot niet van elkaar onderscheiden.

Met deze twee variaties kan er ook gerekend worden. Het toevoegende effect laat een meting zien dat de verandering in het fenotype laat zien. De formule is:

Formule 15 (zie bijlage)

Het dominante effect is de deviatie van de twee homozygote klassen. De formule is:

Formule 16 (zie bijlage)

Waardes tussen 0 en 1 zijn gedeeltelijk dominant en waardes tussen 0 en -1 zijn gedeeltelijk recessief. Het ratio van de toevoegende- en dominante variatie laat de gen interactie zien.

Het voorspellen van het fenotype van de nakomelingen kan wel bepaald worden wanneer er sprake is van pure toevoeging. De toevoegende- en de dominante variatie worden dan gescheiden door de x = g + e formule. Deze formule wordt omgeschreven naar x = a + d + e. Hiervan worden de deviaties genomen. Dit houdt in dat de berekende waarde voor elke variabele min het gemiddelde wordt gedaan. De toevoegende deviatie is extra van belang bij planten en dieren, want er is nog de breeding waarde. Er kunnen namelijk verschillende kruisingen uitgevoerd worden en diegene met de meeste of beste genen worden gekruist (RR bijvoorbeeld).

Ook kunnen de toevoegende variantie en de dominante variantie berekend worden: V_x = V_a + V_d + V_e. De toevoegende variantie is de fractie van de genetische variantie dat doorgegeven wordt van ouder naar kind.

De korte-zin overerving is de ratio tussen de toevoegende variantie en de totale fenotypische variantie. De formule is:

Formule 17 (zie bijlage)

Om de toevoegende variantie te berekenen, wordt er gekeken naar de covariantie tussen ouders en kind. De formule luidt:

Formule 18 (zie bijlage)

De helft V_a wordt gebruikt, aangezien het kind de helft van de oudergenen gebruikt. De omgevingsfactoren is vaak lastig uit te rekenen. De Vx wordt vaak berekend, door de variantie tussen de ouders te nemen. Als h² 1 is dan is het fenotype van het kind hetzelfde als de variantie tussen de ouders. Als h² 0 is, dan is de waarde van het fenotype van het kind het gemiddelde van de populatie. Als laatste is het van belang om te begrijpen dat de h² ook hier per populatie kan verschillen.

Nu zal er verder besproken worden hoe de fenotypes van nakomelingen voorspelt kunnen worden. De formules van de ouders zijn:

moeder: x’ = a’ + d’ + e’ vader: x’’ = a’’ + d’’ + e’’

kind: x = a’ + a’’ / 2 = a_{gem ouders}

De dominante deviaties worden niet doorgegeven, aangezien de kinderen nieuwe combinaties maken van allelen. Ook de omgevingsdeviaties worden niet doorgegeven, aangezien de ouders en kinderen in verschillende tijden en omgevingen opgroeien. Het fenotype van het kind kan voorspelt worden met de volgende formule:

Formule 19 (zie bijlage)

Als dit alles is uitgerekend, kan het gemiddelde er nog bij worden opgeteld en dan is het fenotype ongeveer bekend.

Door de beste soorten te kruisen, ontstaan er ook betere nakomelingen. Dit is veel toegepast bij planten en gewassen. Kruisingen door mensen gedaan, wordt kunstmatige selectie genoemd. De formule die hiervoor nodig is:

h² = x̄_o / x̄_p

De x̄_o stelt de selectie respons (R) voor. Deze wordt berekend door het verschil te bepalen tussen het nakomelingen gemiddelde en het populatie gemiddelde. De x̄_p stelt het selectie verschil (S) voor. Deze wordt berekend door het verschil te bepalen tussen het gemiddelde van de geselecteerde groep en het populatiegemiddelde.

Kunstmatige selectie kan gedaan worden bij bijna elk organisme en elke eigenschap.

19.5 Het in kaart brengen van QTL binnen populaties met bekende stambomen

QTL staat voor ‘quantative trait loci’ en dit zijn de genen die controle over de variatie van complexe eigenschappen hebben. Het zijn simpelweg genen die we al eerder hebben ontmoet, alleen ze bevatten een extra controle eigenschap. Het is van belang om de locatie van deze genen te kennen en dat wordt gedaan door QTL kaarten maken.

Het idee achter QTL’s in kaart brengen, is dat men de locatie van QTL kan identificeren in het genoom met behulp van markeringsloci die gekoppeld zijn aan een QTL. De methode werkt als volgt. Stel dat je een kruising tussen twee inteeltstammen maakt. Ouder 1 met een hoge waarde van de eigenschap en ouder 2 met een lage waarde van de eigenschap. De F1 kan worden teruggekruist met P1 zodat er een BC1 populatie ontstaat. Hier zullen de allelen op alle genen in de twee ouderlijke genomen gescheiden worden. Markeringsloci, bijvoorbeeld SNP's of microsatellieten, kunnen worden bepaald als homozygote P1 of heterozygoot voor elke BC1 individu. Als er een QTL gekoppeld is aan de markeringslocus, dan is het gemiddelde van de eigenschap voor individuen die homozygoot P1 zijn anders dan het gemiddelde van de heterozygoten. Op basis van een dergelijk bewijs, kan men afleiden dat een QTL is gelegen nabij het merkerlocus. De verdeling van de verschillende genotypen QTL is te zien op figuur 19-11 op bladzijde 683.

De statistiek wordt hiervan in het boek niet behandeld, aangezien het zeer ingewikkeld is. Het idee wordt wel uitgelegd. Wanneer er geen QTL is, dan bestaat de data uit een enkele verdeling waarvan het gemiddelde en de variantie uit de gehele BC1 populatie komt. Als verschillende genotypen bij een markeringsloci verschillende gemiddelden hebben voor een eigenschap, dan is er bewijs voor een QTL bij de markeringsloci. Hetgeen wat geleerd kan worden van het in kaart brengen van QTL is:

• Het aantal QTL dat zich bemoeit met een eigenschap

• De locaties van deze genen in het genoom

• De grootte van het effect van elk QTL

• De modus van genactie voor de QTL (toevoegend versus dominant)

• De interactie tussen QTL’s en of de ene QTL de andere beïnvloedt

Nadat de locatie bekend is, is nog niet alles duidelijk over de functie van een QTL. Hierdoor worden er experimenten gedaan die de kaarten verfijnen. Deze lijnen van organismen zijn identiek voor alles, behalve het QTL (isogeen).

19.6 Associatie mapping bij random parende populaties

Associatie mapping is een methode voor het vinden van QTL’s in het genoom gebaseerd op natuurlijk gekoppelde disequilibrium, tussen een markeringsloci en de QTL in een populatie waar organismen random met elkaar paren. Dit soort methoden worden gebruikt om associaties tussen genen en fenotypen aan te duiden (autisme, schizofrenie, etc.). Een kandidaat gen is een gen dat mogelijk betrokken is bij het fenotype van belang. Kandidaat genen zijn niet nodig bij genoom-associatie studies. Deze kijken namelijk naar het hele genoom en bekijken de verschillen tussen mensen. Associatie mapping heeft drie voordelen ten opzichte van QTL mapping: 1) paringen vinden random plaats, dus er hoeven geen kruisingen uitgevoerd te worden, 2) er worden meer dan twee genen getest en 3) zonder finemapping kan de functie van QTL’s al duidelijk worden. Er wordt hier gekeken naar polymorfen, SNP’s, om te kijken of genotypen gecorreleerd zijn en dus automatisch of eigenschappen gecorreleerd zijn.

Er zijn al vele studies gedaan die hebben gekeken naar SNP’s tussen een hele grote groep mensen en vervolgens gekeken of deze mensen ziektes ontwikkelden. Er zijn hierdoor al vele aanwijzingen voor ziekten. Voorbeelden zijn reuma en diabetes. Ooit kan je je persoonlijke genoom inleveren en kijken welke risicogenen jij hebt.

20. Evolutie van genen en karakteristieken

Darwin vond de Galapagos eilanden verschrikkelijk, maar een aantal jaar later zag hij dat hij op drie verschillende eilanden, drie verschillende spotlijsters had gevonden. Hierdoor kwam hij op het idee van natuurlijke selectie: organismen met de beste eigenschappen produceren meer nakomelingen en overleven langer. Vinken hebben het proces adaptatie laten zien. De verschillende vinken, vegetarisch of vleeseters, hebben zich aangepast aan wat hun omgeving aan eten bood. Alleen begreep hij de biologische en moleculaire kant er niet van. Dit is sindsdien onderzocht en zal in dit hoofdstuk aan bod komen.

20.1 Evolutie door natuurlijke selectie

Lamarck, die eerder leefde dan Darwin, bedacht dat verandering van organismen kwam door invloeden van de omgeving. Deze werden vervolgens aan de nakomelingen doorgegeven. Darwin en Wallace hadden ook door dat individuen binnen soorten ook verschillen. Ook bedachten ze dat de individuen met de beste eigenschappen nakomelingen produceren die ook weer meer kans hebben op overleven. Hierdoor wordt de frequentie van die beste eigenschappen groter. Kunstmatige selectie doet precies hetzelfde: het selecteren van de betere eigenschappen. De evolutie theorie bevat drie principes:

• Principe van variatie: onder individuen binnen een populatie, is er variatie in morfologie, fysiologie en gedrag.

• Principe van overerving: nakomelingen lijken meer op hun ouders dan op andere, onverwante individuen.

• Principe van selectie: sommige vormen zijn meer succesvol in het overleven en het produceren van nakomelingen in een bepaalde omgeving dan anderen.

Evolutie, de verandering in populaties of soorten na verloop van tijd, is de omzetting van erfelijke variatie tussen individuen binnen populaties naar erfelijke verschillen tussen populaties door de bevolking genetische mechanismen. Deze mechanismen zijn drift, migratie en selectie tegen heterozygoten, gebalanceerde polymorfismen, mutaties en direct selectie.

20.2 Moleculaire evolutie: de neutrale theorie

De neutrale moleculaire evolutie is van belang als je de verandering van genen wil begrijpen. De neutrale theorie van de moleculaire evolutie stelt dat de meeste mutaties in DNA of aminozuur vervangingen tussen soorten functioneel neutraal of bijna neutraal zijn. Door willekeurige genetische drift worden deze vast gezet in het genoom. De aanname van de neutraliteit biedt een basis verwachting van hoe DNA zou moeten veranderen in de tijd wanneer de natuurlijke selectie afwezig is. Dit is ook te verwerken in een formule:

Formule 20 (zie bijlage)

Hierbij verwachten we een vervangen gemiddelde. Hierbij is μ het gemiddelde en N de populatiegrootte.

Het zuiveren van selectie DNA vindt plaats als er een signaal is geweest dat er een verandering heeft plaatsgevonden. Dit kan door positieve neutrale selectie (20.4), deleties door mutaties of juist mutaties die goed werken. Daarnaast veranderen de nucleotiden tussen twee soorten op een constante snelheid: moleculaire klok met de snelheid van μ. Hierdoor kan er bepaald worden wanneer de soorten gescheiden zijn in de evolutie. De snelheid van non-synonieme vervangingen gaat langzamer dan de synonieme vervangen. De non-synonieme is minder gewenst en zal gezuiverd worden (zuiverende selectie). De snelheid van neutrale evolutie voor een aminozuur of eiwit hangt af van de gevoeligheid van hun functie wanneer deze verandert. Als een eiwit zeer belangrijk is en vervangen is, zal dat snel uitgezuiverd worden.

20.3 Natuurlijke selectie in actie: een voorbeeld

Allison ontdekte dat sikkelcelanemie, dat de rode bloedcellen misvormd, een bepaalde resistentie tegen malaria met zich meebracht. Malariacellen leven in rode cellen en dat kon hier niet. Daarom waren de sikkelcelanemie frequenties hoger bij lage gebieden met veel muggen en lager bij hoge berggebieden zonder muggen. Het had een voordeel tegen de muggen. Hier was sprake van gebalanceerde selectie.

Er zit één verschil in aminozuur tussen de HbS (sikkelcellen) en de HbA (normale bloedcellen). De GAG (glutamine) wordt een GTG (valine). Daarnaast heeft deze ontdekking drie punten duidelijk gemaakt van het evolutionaire proces:

• De evolutie kan, en doet dit ook zeker, zichzelf herhalen.

• Fitness is een hele relatieve, conditionele status. Een negatieve of positieve mutatie ligt aan de omgeving.

• Natuurlijke selectie werkt op elke mogelijke variatie en niet per se met de beste gedachten. HbS is niet alleen een bescherming tegen malaria, maar ook een bedreigende conditie.

20.4 Cumulatieve selectie en stapsgewijze paden naar functionele verandering

Er is geen proportionele relatie tussen hoeveel DNA verandert door evolutie en hoeveel verandering er plaats vindt bij de functie. Cumulatieve selectie kan de mutaties vast stellen door veranderende moleculen. Om de rol van selectie te begrijpen wordt er gebruik gemaakt van empirische experimenten en statistische methoden.

Meerdere paden kunnen leiden tot dezelfde mutatie (adaptive walks). Dit komt doordat er meerdere stappen nodig zijn om tot een mutatie te komen. Weinrich en collega’s hebben een onderzoek gedaan en hebben ontdekt dat een E. coli bacterie meer resistent is als deze meer stappen in de mutatie heeft ondergaan. De afhankelijkheid van een fitness voordeel of nadeel van een mutatie, op al eerdere mutaties, wordt signaal epistasis genoemd. De volgorde waarin mutaties plaatsvinden is van cruciaal belang om het evolutiepad te ontdekken. Ook om te kijken of de evolutie door natuurlijke selectie wel of niet de meest voordelige status behaald wordt. Omdat de volgorde van voorkomen van mutaties random, worden vele voordelige fenotypes niet bereikt.

Onder identieke omstandigheden kunnen twee populaties dezelfde genetische mutatie ondergaan. Dit gebeurt wel bij identieke omstandigheden in de evolutie.

Ook al hebben er mutaties plaatsgevonden, vaak is het lastig om te zien waarom deze mutaties plaats hebben gevonden. Daarom worden de synonieme en non-synonieme nucleotiden met de synonieme en non-synonieme nucleotide veranderingen vergeleken. Als de ratio’s gelijk zijn, dan is er sprake van neutrale mutaties.

20.5 Morfologische evolutie

De morfologische evolutie vindt plaats door vervangende coderingen, gen inactivatie en regulerende sequentie evolutie. Morfologische divergentie zijn de verschillen tussen soorten.

De best begrepen morfologie is vachtkleur. Deze verschillen onderling in soorten ten opzichte van hun omgeving. Muisjes die in een zandomgeving leven, hebben een lichte kleur bijvoorbeeld. Melanisme is wanneer er in zo een soort een donkere muis is, die vaak leeft in lava omgevingen. Een mutatie kan voordelig zijn bij de ene populatie, maar bij de andere populatie is het beter dat deze mutatie verdwijnt. Het alpha-MS hormoon bindt aan het MC1R eiwit wat ervoor zorgt dat er pigment aangemaakt wordt. Het agouti eiwit blokkeert juist MC1R.

Het Oca2 gen zorgt voor pigment en is verdwenen bij visjes die in het donker leven. Dit gen is inactief gesteld door een mutatie. Dit heeft twee waarschijnlijke reden. 1) de Oca2 inactivatie is niet pleiotropisch, waardoor er geen andere belangrijke functies voor het overleven inactief zijn. 2) Het gen is zeer groot, waardoor er vele mutaties in kunnen voorkomen wat normaal gesproken niet voordelig is. Daarnaast is het meerdere keren voorgekomen dat visjes hun pigment verliezen.

Mutaties kunnen ook bijwerkingen hebben binnen coderende en regulerende sequenties. Evolutionaire veranderingen bij cis-werkende regulerende genen, spelen een kritieke rol in de evolutie van het lichaam. Ze laten de pleiotropische genen zien, aangezien deze meerdere functies hebben, is er ook meer verandering te zien. Mutaties kunnen ook voordelig zijn. Een voorbeeld is dat delen van lichamen verdwijnen, omdat het dan makkelijker is om te bewegen of om te jagen. Zo is te zien dat morfologische veranderingen door geninactivatie eigenschappen kunnen verdwijnen of verkregen kunnen worden. Bij mensen is een regulerende mutatie het Duffy gen. Hierbij zorgt de mutatie ervoor dat malaria parasieten niet de rode bloedcellen kunnen binnendringen.

20.6 De oorsprong van nieuwe genen en eiwitfuncties

Er zijn meerdere genen die voor één functie in het organisme coderen (gen families). Een voorbeeld hiervan is het olfactorische systeem met meer dan duizend genen. Een vraag die gesteld kan worden is waar de nieuwe genen vandaan komen? Hier zijn vier mechanismen voor:

• Polyploïdes zijn individuen met meer dan twee chromosomen. Hier vindt er duplicatie van één heel chromosoom plaats.

• Gen duplicatie kan ruimte bieden voor mutaties of nieuwe sequenties.

• Transpositie kan zorgen voor andere sequenties, omdat genen ergens anders geplaatst worden.

• Retrotranspositie die zichzelf verdubbelen.

Het lot van een gen wordt bepaald door zijn functie. Er zijn drie lotbepalingen van genen. Er kan een pseudogen optreden door een inactiverende mutatie. Ook kan er door positieve selectie een nieuwe functie ontstaan (neofunctionalisme). En er zijn ook subfunctionele genen. Dit zijn genen die dezelfde duplicatie en mutatie doormaken. Beide paralogen worden behouden.

22. Het reconstrueren en het gebruik maken van fylogenese

Green Fluorescent Protein (GFP) is ontdekt in 1962 door Osamu Shimomura en zijn team. Dit eiwit kwam uit de weefsels van een kwal. Dertig jaar na ontdekking kwam Martin Chalfie met de techniek om het gen voor GFP met een ander eiwit te verbinden; om zo specifieke genen te visualiseren in cellen en weefsels van levende organismen. Ook heeft meneer Tsien hieraan meegewerkt en zorgde ervoor dat niet alleen de kleur groen gebruikt kon worden. Alleen rood kon hij niet maken, wat erg frustrerend was aangezien dat een kleur is die duidelijk door weefsel heen schijnt. Meneer Matz heeft deze kleur, samen met groen en cyaan, uit koraal verkregen. Verrassend genoeg waren de fluorescerende eiwitten geëvolueerd van groen, naar rood in een aantal stappen. Een dergelijke evolutionaire geschiedenis, vaak afgebeeld als een boomdiagram van relaties tussen geslachten, heet een fylogenie. Vele aspecten in de biologie, zoals de evolutie, structuur, functie en gedrag van organismen, kunnen door de fylogenese verklaard worden.

22.1 Wat is fylogenie?

Fylogenie is de geschiedenis van de evolutionaire relaties tussen organismen of hun genen. Dit kan weergegeven worden in een boomdiagram. De soort begint op een bepaald punt in de tijd en leeft rustig voort. Dit wordt op een tijdsschaal uiteen gezet. Als de tak zich splitst in twee takken, betekent dat dat er een verschil is opgetreden tussen een soort die eerst nog hetzelfde was. Elke lijn ontwikkeld zich vervolgens onafhankelijk van de andere lijn. Vervolgens kunnen er nog meer vertakkingen optreden. Dit betekent dat er meerdere scheidingen tussen soorten zijn. Deze bomen kunnen aangeven in hoeverre een soort gelijk is aan een andere soort. De evolutie van soorten, zoals een grote groep insecten of juist individuele gezinnen, kan hier worden aangegeven.

De linkerkant vertegenwoordig vaak de oudste soorten. De bomen kunnen verschillende soorten splitsingen aangeven: soortvorming gebeurtenis, een gen duplicatie gebeurtenis (een genenboom), of een transmissie gebeurtenis (een boom van virale lijnen die via een gastheer bevolking overleefd). Dit is de horizontale as en geeft de tijd tussen soorten en splitsingen aan. De verticale as is niet leesbaar en wordt op een manier ingesteld waardoor het makkelijker wordt om de boom te lezen.

Een soort of groep van soorten die we aanduiden of de naam van een taxon (meervoud taxa) genoemd, zoals mensen of insecten. Elk taxon dat bestaat uit een voorouder en alle evolutionaire nakomelingen wordt een clade genoemde. Twee soorten die elkaars naaste verwanten zijn, worden zuster soorten genoemd en twee verwante clades, worden zuster clades genoemd.

Voor 1980 werden fylogenetische bomen zichtbaar gemaakt in de literatuur over evolutionaire biologie en dan vooral op het gebied van systematiek: de studie en classificatie van biodiversiteit. Tegenwoordig worden deze bomen bijna op elk vlak gebruikt.

De volledige evolutionaire geschiedenis van het leven staat bekend als de boom des levens. Dit is dus een hele grote boom met alle levende en dode soorten op de hele wereld sinds het ontstaan van de aarde. Deze is nog lang niet volledig en zelfs van bekende soorten weten we vrij weinig. De evolutionaire relaties tussen soorten, zoals in de boom van het leven, vormen ook de basis voor de biologische classificatie. Dit evolutionaire kader zorgt ervoor dat biologen voorspellingen kunnen maken over het gedrag, de ecologie, de fysiologie, de genetica en de morfologie van soorten.

Wanneer biologen soorten vergelijken, komen ze verschillende eigenschappen tegen. Het is van belang om te weten hoe soorten veranderen door omgevingscondities of selectiedruk. Hierdoor kan er resistentie tegen bepaalde medicijnen begrepen worden.

Een eigenschap die meerdere soorten met elkaar delen, heet een homoloog kenmerk. Deze zijn dan waarschijnlijk geërfd van een gemeenschappelijke voorouder. Er zijn hierbij twee soorten eigenschappen: 1) een voorouder eigenschap en 2) een verkregen eigenschap. De voorouder eigenschap heeft een soort gelijk met zijn voorouder. Een verkregen eigenschap is door de evolutie ontwikkeld en is verschillend ten opzichte van de voorouder eigenschap. Een synapomorfie is een eigenschap die ontstond in de voorouder van een fylogenetische groep. Daarnaast is deze aanwezig, al dan niet in gewijzigde vorm, in al haar leden om zo een groep af te bakenen en te identificeren.

Niet alle soortgelijke kenmerken zijn het bewijs van verwantschap. Soortgelijke kenmerken kunnen ontwikkelen in niet verwante groepen voor een van de volgende redenen:

• Convergente evolutie: sommige soorten, die wel verschillend van elkaar zijn, kunnen door selectiedruk dezelfde eigenschappen ontwikkelen.

• Evolutionaire omkering: een eigenschap kan terugkeren naar een voorouderlijke toestand.

Soortgelijke kenmerken in ver verwante taxa die veroorzaakt worden door convergente evolutie of door evolutionaire omkeringen worden homoplastisch eigenschappen genoemd, en soms homoplasies.

22.2 Hoe worden fylogenetische bomen gemaakt?

De groep van organismen van primair belang heet de ingroep. Deze wordt vergeleken met een outgroep: een soort die nauwverwant is aan de ingroep, maar de onderdelen van belang hebben ze niet gemeen. De eigenschap die in beide groepen voorkomt, is ontstaan voor de evolutie van de ingroep. Een eigenschap die alleen in de ingroep voorkomt, is apart geëvolueerd van de outgroep.

In een tabel waarin eigenschappen wel of niet aangegeven worden tussen verschillende soorten, kan enkele dingen laten zien. Welke dieren synamorfie laten zien, welke eigenschappen uniek zijn voor soorten of welke soorten nauwe relaties hebben. Samen met deze tabel kan een fylogenetische boom gemaakt worden. Door gedeelde kenmerken is bekend dat elke afgeleide eigenschap slechts eenmaal ontwikkeld, want hij is niet verdwenen.

Wetenschappers maken fylogenetische bomen met wel honderd, soms duizend soorten. Hier komen ook meerdere convergente en omgekeerde evoluties in voor. Hierdoor moeten synamorfies en homoplasies uit elkaar worden gehouden. Dit wordt gedaan door het principe van spaarzaamheid te gebruiken. De voorkeur gaat uit naar de meest eenvoudige verklaring. De spaarzaamheid theorie zorgt voor de minste homoplasies. Hierdoor bevat de fylogenetische boom minder veranderingen. Deze theorie rust op de Occam's razor logica: de beste verklaring is degene die de data het beste past tijdens het maken van de minste aannames.

Al heel lang worden fylogenetische bomen gebruikt, maar tegenwoordig kunnen ze beter en groter gemaakt worden met behulp van de computer. Evolutionaire relaties kunnen worden onthuld door verschillende studies:

• Morfologie: de aanwezigheid, grootte, vorm en andere kenmerken van lichaamsdelen. CT- en andere scans kunnen systematisch structuren van organismen op fijnere schaal analyseren. Deze studie wordt ook het meest gebruikt voor fylogenetische bomen. Het uiterlijk wordt soms bepaald door de omgeving, in plaats van de genen. Een nadeel is dat er moeilijk of bijna geen vergelijking kan worden gemaakt tussen gerelateerde soorten.

• Ontwikkeling. Overeenkomsten in ontwikkelingspatronen kunnen evolutionaire relaties onthullen. Sommige organismen vertonen gelijkenissen alleen in vroege ontwikkelingsstadia.

• Paleontologie. Fossielen tonen ons waar en wanneer organismen leefden in het verleden en geven ons een idee van hoe ze eruit zagen. Helaas zijn er niet voor alle gewilde organismen fossielen en de meeste fossielen zijn fragmentarisch.

• Gedrag. Sommige gedragskenmerken zijn cultureel overgedragen en sommige zijn erfelijk. Als een bepaald gedrag cultureel wordt doorgegeven, kan het geen accurate weergave van evolutionaire relaties zijn. Denk hierbij aan liedjes van zangvogels.

• Moleculaire data. Alle erfelijke variatie ligt in het DNA en codeert voor eigenschappen. Hierbij kunnen hele specifieke kenmerken gescheiden worden van andere organismen. De mitochondriën en chloroplasten zijn hele oude delen van organismen en zijn daarom van belang voor de evolutie.

Wiskundige modellen breiden de macht uit van fylogenetische reconstructie. Ze houden rekening met verschillende tarieven van verandering op verschillende posities in een gen, codon of nucleotiden.

Wiskundige modellen kunnen worden gebruikt om te berekenen hoe een boom zou kunnen evolueren, met de methode maximale waarschijnlijkheid, gezien de geobserveerde data. Ze kunnen makkelijker analyses doen dan de spaarzaamheidtheorie en zijn makkelijk te gebruiken met statistische toetsen. De nadelen zijn dat ze erg reken intensief zijn en wiskundige modellen vereisen die moeilijk te formuleren zijn voor evolutionaire veranderingen.

Wetenschappers maken fylogenetische bomen over een hele tijd geleden, terwijl er niet eens mensen waren. Hierdoor zijn er methoden ontwikkeld die de doeltreffendheid en de nauwkeurigheid van fylogenetische bomen nakijken. Hills en Bulls hebben zo een experiment gedaan met bacteriën. Hierbij keken ze hoe de bacteriën evolueerden. Ze hebben hierbij bomen gemaakt en vervolgens aan andere wetenschappers, zonder de uitkomst te vermelden, twee vragen gesteld: 1) Heeft deze fylogenetische methode de evolutie van de bacterie goed nagemaakt en 2) zijn de voorouderlijke bacteriën goed nagemaakt? Het antwoord op beide vragen was overduidelijk ‘ja’. Helaas is dit vaak niet mogelijk door omstandigheden. Andere studies hebben hierbij gekeken naar sensitiviteit van de fylogenetische analyse of juist gekeken naar hoge variatie veranderingen. Computersimulaties, gebaseerd op wiskundige modellen van evolutionaire veranderingen, zijn ook gebruikt om de doeltreffendheid van fylogenetische analyse te bestuderen. Deze studies hebben ook de nauwkeurigheid van de fylogenetische methoden bevestigd en zijn gebruikt om deze methoden te verfijnen.

22.3 Hoe gebruiken biologen de fylogenetische bomen?

Fylogenetische bomen kunnen worden gebruikt om gebeurtenissen uit het verleden te reconstrueren. Hierdoor kunnen er biologische processen begrepen worden. Zo een proces is bijvoorbeeld het binnendringen van een virus in een gastheercel (HIV). Ook kan er bepaald worden hoe dergelijke virussen in elkaar zitten en wat de oorsprong is. Uit de fylogenetica is gebleken dat we deze virussen van chimpansees (HIV-1) en roetmangabey (HIV-2) hebben gekregen. Dit komt door het jagen op deze beesten en vervolgens te eten of juist bij het villen van deze beesten zichzelf snijden en zo bloed uitwisselen.

Fylogenetische analysen worden ook gebruikt om levende organismen te vergelijken met vroegere organismen. Zo kan er gekeken worden wat van belang was om voort te planten. Bij een groep vissen, de Xiphophorus, bleek dat vrouwtjes de lange staarten heel erg mooi vonden, aangezien mannetjes met lange staarten meer kans hadden om zich voort te planten. Om dit vast te stellen werd een analyse gedaan met voorouders van deze vis.

Daarnaast kunnen fylogenetische reconstructies convergente evolutie onthullen. Sommige planten kunnen zichzelf bestuiven, maar andere planten hebben daarvoor insecten nodig (zelfincapabel). De laatste planten hebben dus mechanismen nodig om zichzelf toch voort te kunnen planten. Een voorbeeld van zo een plant is de Leptosiphon. Deze had langere blaadjes en werd bestoven door vliegen. De zelfbestuivende soorten hadden juist korte blaadjes en geen insecten nodig om zich te bestuiven. Deze zijn onderling gekruist, waarnaar er is gekeken naar de ribosomale DNA sequenties, en een analyse heeft bepaald dat de zelfincapabele kruisers een voorouderlijke staat is. Deze voorouderlijke staat, niet-zelfbestuiving, is drie keer geëvolueerd waardoor er drie verschillende geslachten zijn. Echter lijken ze veel op elkaar. Dit betekent dat zelfbestuiving en de bijbehorende bloemstructuur het gevolg is van convergente evolutie in de drie onafhankelijke lijnen.

Ook kunnen er voorouderlijke staten gereconstrueerd worden. Deze kan informatie geven over uitgestorven organismen. Dit werd gedaan bij een opsin eiwit dat voorkomt in een archosaur (voorouder van vogels, dinosauriërs en krokodillen). Dit is een eiwit dat te maken heeft met gezichtsvermogen. De archosaur had dit eiwit op een andere plek, het is dus verplaatst, waarbij het aangaf dat dit dier in de nacht leefde.

Als laatste kunnen moleculaire klokken helpen om data van evolutionaire gebeurtenissen vast te stellen. De moleculaire klok hypothese is van Zuckerkandl en Pauling. Deze stelt dat snelheden van moleculaire veranderingen constant waren en dat ze hierdoor gebruikt konden worden om evolutionaire veranderingen te voorspellen. Het eiwit evolueert op dezelfde snelheid mee. Informatie voor deze moleculaire klok komt van fossielen, al bekende tijden en biogeografische data (scheiding continenten). De moleculaire klok hypothese is ook gebruikt om de oorsprong van het HIV-virus te bepalen. Dit is een recent virus en betekent dat de hypothese niet alleen voor oude tijden gebruikt wordt.

22.4 Hoe hangen classificatie en fylogenie samen?

De biologische classificatie is bedacht door Linnaeus rond 1750 en heet de binomiale nomenclatuur. Elke soort kreeg twee namen voor identificatie van de soort en een genus. Genus (mv. genera) is groep nauw verwante soorten. Soms wordt hier het taxonoom voor gebruikt. De eerste naam wordt met hoofdletter geschreven, beide namen cursief en na één keer de volledige naam te hebben gebruikt, wordt de afkorting genoteerd. In het systeem worden organismen verder geclassificeerd dan alleen een taxon. Boven de genus staat de familienaam en eindigt op -idae (bijvoorbeeld: Hominidae zijn alle mensen en gerelateerde apen).Bij planten wordt –aceae op het einde gebruikt. Verder worden familie gegroepeerd op de volgende classificaties in deze volgorde: orden, klassen, phyla (enkelvoud: phylum) en rijken. Een nadeel aan deze indeling is dat er subjectiviteit bestaat over welke eigenschap in welke classificatie hoort. Tegenwoordig wordt deze classificatie nog wel gebruikt, maar ook worden namen aan organismen gegeven door middel van hun taxa en evolutionaire relaties.

Evolutionaire geschiedenis is de basis voor de moderne biologische classificatie. Deze worden gebruikt om relaties tussen organismen duidelijk te maken. Tegenwoordig moeten taxa monofyletisch zijn: de taxon bevat een voorouder en alle nakomelingen van die voorouder. Dit is hetzelfde als een clade. Polyfyletisch is het tegenovergestelde van monofyletisch en houdt een groep in van verwante organismen, maar bevat niet de gemeenschappelijke voorouder. Dit kan bijvoorbeeld door te weinig kennis. Een groep die niet alle nakomelingen bevat van de gemeenschappelijke voorouder, heet een parafyletische groep. De moderne basis voor biologische classificatie is dat pure monofyletische groepen compleet van een boom verwijderd kunnen worden en dat elke tak weer subverdelingen heeft. Toch worden monofyletische- en polyfyletische groepen niet gebruikt voor taxon namen, omdat ze evolutionaire geschiedenis niet goed weerspiegelen.

Er zijn verschillende regels waar biologen zich aan moeten houden voor de naamgeving. In de wetenschappelijke wereld is voor elk organisme één naam. Als er meerdere namen worden aangeboden, wordt de eerste naam gebruikt. Soms krijgen twee verschillende organismen dezelfde naam, door onafhankelijke onderzoekers, hierbij wordt er voor het tweede organisme een nieuwe naam bedacht. Een schimmel en een fruitvliegje hebben dezelfde eerste naam Drosophila, maar dat was in het begin niet erg aangezien onderzoekers van schimmels en fruitvliegjes niet snel in contact kwamen. Tegenwoordig is dat vervelender met alle gezamenlijke genenbanken.

23. Soortvorming

Doordat de vissoort haplochromine cichlid in een apart meer terecht kwam, moesten ze zich aanpassen aan nieuwe omstandigheden. Sommige leefden op zand, andere in stenen. Ook moest hun dieet aangepast worden aan de nieuwe omstandigheden, waardoor hun mond morfologie ook toenam. Daarnaast wilde mannetjes allemaal het vrouwtje veroveren en deden dit met uiterlijke verschillen. Hierdoor ontstonden er vele soorten visjes in het meer Malawi.

23.1 Wat zijn soorten?

Een soort is een groep van organismen die kunnen paren en vruchtbare nakomelingen kunnen krijgen. Dit is het resultaat van soortvorming: uiteenlopende biologische lijnen en het ontstaan van reproductieve isolatie tussen soorten. Aangezien wetenschappers verschillende vragen willen beantwoorden, kijken ze ook anders naar soorten. Hierdoor ontstaan er verschillen soortconcepten, maar de echte vraag is: ‘wat zijn soorten?’

Vele soorten kunnen we herkennen aan hun uiterlijk. Linnaeus heeft de binomiale nomenclatuur op basis van uiterlijk gedaan, aangezien hij geen kennis had over de genetica of paargedrag. Hij gebruikte dus het morfologische soortconcept: dieren met een gelijk uiterlijk behoren tot dezelfde soort en dieren met een ongelijk uiterlijk behoren niet tot dezelfde soort. Deze methode heeft zijn nadelen, want leden van dezelfde soort lijken niet altijd op elkaar. Ook lijken sommige soorten op elkaar, maar paren die helemaal niet met elkaar. Tegenwoordig worden gedrags- en genetica informatie gebruikt om soorten te onderscheiden.

De belangrijkste factor in de divergentie van seksueel voortplanten tussen soorten is de evolutie van reproductieve isolatie. Dit is een toestand waarbij soorten alleen nog maar onderling paren en geen genen uitwisselen met andere soorten. Soort A paart alleen maar met soort A. Hierdoor kwam Mayr met het biologische soorten concept: ‘Soorten zijn groepen van werkelijke en potentiële (ook al paren ze niet, er is wel een mogelijkheid) kruisingen van populaties die reproductief geïsoleerd van andere groepen’.

Evolutionaire biologen kijken naar soorten als vertakkingen in de levensboom. Dit wordt aangeduid met de term ‘lineage species concept’. Hierbij splitst een soort in twee takken die vervolgens apart evolueren.

De verschillende soorten concepten sluiten elkaar niet uit. Ze benadrukken verschillende aspecten van soortvorming. Het morfologische soort concept kijkt naar het uiterlijk, het biologische soort concept kijkt naar reproductieve isolatie en het lineage species concept kijkt ook naar reproductieve isolatie, maar dan nog verder de evolutie in. Reproductieve isolatie is ook van belang voor morfologische aspecten. Darwin keek naar natuurlijke selectie, maar dit hoofdstuk zal verder gaan dan alleen de natuurlijke selectie.

23.2 Wat is de genetische basis van soortvorming?

Een enkele lijn kan veranderen in de tijd, maar niet voor een nieuwe soort zorgen. Hier is genetische uitwisseling voor nodig. Alleen hoe is dit mogelijk tussen verschillende soorten? Als een nieuw allel ontstaat dat reproductieve afkeer veroorzaakt, kan het niet door de populatie verspreiden, omdat er geen andere soorten verenigbaar zijn met dit allel. Toch gebeurt dit wel en Dobzhansky en Muller hebben hier een verklarend model voor. Stel dat twee soorten scheiden van elkaar en onafhankelijk verder evolueren. In de ene populatie evolueert allel A en in de andere populatie evolueert allel B. De eiwitproductie van de twee allelen kan wel of niet samenwerken. Als de populaties kruisen kunnen deze allelen voor nieuwe combinaties zorgen. Vervolgens zijn deze allelcombinaties dodelijk of juist bevorderend. In de loop van de tijd zullen er combinaties overblijven die wel werken. Dit model werkt ook met chromosomale herschikkingen.

Reproductieve isolatie ontstaat door toenemen genetische divergentie. Gelijke genetische soorten laten vaak weinig reproductieve isolatie zien. Ongelijke genetische soorten laten vaak veel reproductieve isolatie zien. De Phlox drummondii is kunstmatig geïsoleerd door de mens. Thomas Drummond had zaadjes van deze plant naar Europa gebracht en hier zijn ze verder gekweekt. Twee eeuwen later is er geconcludeerd dat de reproductieve afkeer met 14-50% is afgenomen.

23.3 Welke belemmeringen resulteren in soortvorming?

Fysieke barrières die soortvorming stimuleren, wordt allopatrische soortvorming genoemd. Dit kan door water, bergen of continentscheidingen. Een resultaat zijn zuster soorten. Dit zijn soorten die het meest verwant aan elkaar zijn. Allopatrische soortvorming kan ook ontstaan als een deel van de populatie een bestaande barrière passeert. Zij beginnen dan een nieuwe geïsoleerde populatie. Dit is het geval bij fruitvliegjes op de Hawaiiaanse eilanden. De bekendste vorm van allotropische soortvorming zijn de vinken die Darwin op de Galápagos eilanden tegen kwam. Deze leven op verschillende eilanden en hebben zich op die eilanden aan moeten passen. Dit resulteerde in vele soorten vinken: zaad-, knop- of insecteneters.

Soortvorming zonder fysieke isolatie is ook mogelijk. Dit wordt sympatrische soortvorming genoemd. Alleen als de soort gewoon met elkaar kunnen paren, hoe kan er dan isolatie optreden? Dit wordt veroorzaakt door disruptieve selectie: selectie waarin fenotypen van beide extremen in de populatie de voorkeur hebben. Een voorbeeld hiervan zijn appelvliegjes. Deze paren het liefst met andere appelliefhebbers, terwijl ze oorspronkelijk op meerdere bomen paarden. Een ander mechanisme van sympatrische soortvorming is polyploïdie. Deze soort komt vaker voor dan disruptieve selectie. Het is een verdubbeling van een set chromosomen binnen individuen (autopolyploïdie) of een twee chromosomen van twee verschillende soorten worden gecombineerd (allopolyploïdie). Autopolyploïdie ontstaat wanneer een diploïde (chromosomenpaar) en een tetraploïde (dubbele chromosomen paren) gaan paren. Hun nakomelingen zijn triploïde en vaak steriel. Ook zijn ze nauwelijks levensvatbaar, maar het kan wel door zelfbevruchting of een toevallige levensvatbaarheid verder paren. Vervolgens komen er nieuwe combinaties die een ander aantal chromosomen heeft. Allopolyploïdie ontstaat doordat twee verschillende individuen, maar nauw verwant, met elkaar kruisen. Dit kan leiden tot een verstoorde meiose en chromosomale verdubbeling. Bij planten komt polyploïdie zeer veel voor door de zelfbevruchting. Ook omdat vaak zussen en broers gekruist worden.

23.4 Wat gebeurt er als nieuwe soorten weer in contact met elkaar komen?

Als soorten niet meer bij elkaar zijn, zal de reproductieve isolatie beginnen door genetische divergentie. Deze divergentie zorgt er ook voor dat de kans kleiner wordt dat deze soorten nogmaals met elkaar paren. De reproductieve isolatie kan incompleet zijn als ze weer in contact komen, maar bij sommige zal hybridisatie optreden. De hybridisaties zijn meestal in het nadeel en de selectie zal deze door versterking eruit halen. Deze mechanismen worden prezygotisch isolerende mechanismen genoemd. Mechanismen die de fitness minder laten aansluiten bij de nakomelingen heet postzygotische isolerende mechanismen.

Prezygotische mechanismen:

• Mechanische isolatie: verschillen in de maten en vormen van reproductieve organen kunnen de vereniging van gameten voorkomen.

• Tijd isolatie: soorten paren op verschillende tijden of seizoenen.

• Gedragsisolatie: vrouwtjes vallen op specifieke kenmerken van hun soort. Zelfs als soorten nauw verwant zijn. Bij planten ligt het eraan of hun bestuivers, vliegen of vogels, wel naar andere planten gaan.

• Habitat isolatie: wanneer soorten andere paring en woonplekken prefereren na hun evolutie komen ze elkaar niet tegen.

• Gametische isolatie: de eicel en zaadcel kunnen niet hechten aan elkaar door verschillende chemische stoffen. Dit is het geval bij het sperma van de zee-egel. Deze kan alleen hechten bij hele specifieke eieren van dezelfde soort.

Er zijn ook een aantal manieren wat de overleving en voortplanting van hybride nakomelingen kan verminderen (prozygotisch):

• Lage levensvatbaarheid hybride zygoten: ontwikkelen niet tot rijpe organismen of sterven tijdens de ontwikkeling.

• Lage hybride volwassen levensvatbaarheid: hybride nakomelingen hebben een lagere overlevingskans dan niet-hybride nakomelingen.

• Hybride onvruchtbaarheid: groeien tot onvruchtbare volwassen.

Natuurlijke selectie is geen voorstander van de evolutie van postzygotische isolerende mechanismen. Soorten die paren met andere soorten hebben een nadeel ten opzichte van soorten die onderling paren. Dit wordt dan ook aangemoedigd door natuurlijke selectie. Als er toch paring met andere soorten plaats vindt, dan zijn prezygotische reproductieve barrières toch efficiënter dan allopatrische populaties.

Hybride zones kunnen worden gevormd als reproductieve isolatie onvolledig is. Deze hybrides zijn vaak nakomelingen van raszuivere hybrides. Gedetailleerde genetische studies kunnen ons veel vertellen over de reden waarom smalle hybride zones, gedurende lange periodes tussen de reeksen van twee soorten, kunnen overleven. Een voorbeeld zijn twee verwante padden. Deze blijven zo lang bestaan, omdat er een hele smalle strook is van overlapping, de padden weinig bewegen en sommige combinaties zijn dodelijk. Toch zijn de hybriden half zo sterk als de rasechte voorouders.

23.5 Waarom verschillen de hoeveelheden van soortvormingen?

Verschillende ecologische en gedragsmatige factoren beïnvloeden de hoeveelheden van soortvorming:

• Dieet specialisatie: soorten die een heel algemeen dieet hebben, evolueren minder snel dan soorten die een heel specifiek dieet hebben.

• Bestuiving: groepen die door dieren bestoven worden, zijn veel diverser dan soorten die door de wind worden bestoven.

• Seksuele selectie: mechanismen voor het selecteren van een seksuele partner, hebben meer diversiteit. Denk hierbij aan de paradijsvogels met alle mooie gekleurde veren en staarten. Hoe complexer het seksueel geselecteerde gedrag, hoe meer diversiteit.

• Dispersie vermogen: hoe zwakker dieren zijn om barrières te overbruggen, hoe sneller er soortvorming optreedt. Als dieren juist water, bergen en andere barrières kunnen overleven, is er minder moeite nodig om naar andere soortgenoten te gaan.

Snelle soortvorming kan leiden tot adaptieve radiatie. Dit houdt de verspreiding in van vele soorten binnen een enkele evolutionaire afstamming. Dit komt bijvoorbeeld voor op een nieuw gebied dat af is geschermd van de rest van de wereld. Op Hawaii zijn er 28 soorten zonnebloemen. Aan de DNA-sequenties is te zien dat deze soorten een relatief recente voorouder hebben. Dit stamt dus allemaal af van één voorouder. De voorouder was niet divers in omvang, maar toen deze op Hawaii aankwam waren er vele andere soorten planten waarmee gekruist kon worden.