Deze samenvatting is gebaseerd op het studiejaar 2013-2014.

Thema II: Monogenetische ziekten en overervingspatronen

Elements of medical genetics, hoofdstuk 1: History and impact of genetics in medicine

Pagina 7-8

John Dalton ontdekte dat sommige ziektes geslachts- of X-chromosomaal gebonden zijn, zoals kleurenblindheid, dat naar hem vernoemd is (Daltonisme). In 1900 kwam medische genetica echt op. Bateson en Garrod ontdekten de monogenetische ziekte (van één enkel gen afhankelijk) alkaptonurie. In 1908 kwam de term 'aangeboren aandoening van het metabolisme' op. Pas midden in de twintigste eeuw kon wat met deze kennis worden gedaan en kon het vak biochemische genetica ontstaan. Hierna werd ontdekt dat aandoeningen monogenetisch, chromosomaal of multifactorieel kunnen zijn. Ook polygenetische overerfbaarheid en somatische genetische ziektes werden als subklassen erkent. McKusick maakte een catalogus van alle monogenetische ziektes, dit zijn er inmiddels bijna 20.000.

Chromosomale aandoeningen werden makkelijker te onderzoeken door bandtechnieken, waardoor verlies of winst van een klein deel van een chromosoom kan worden aangetoond. Ook FISH-techniek helpt hierbij, het combineert cytogenetica met moleculaire genetica. CGH helpt bij het opsporen van kleine oneffenheden in het genoom.

Galton bestudeerde eeneiige tweelingen om de effecten van milieu te bekijken. Ook bedacht hij dat meerdere genen effect kunnen hebben op een eigenschap; dit is te zien als een eenparige lijn (regressiecoëfficiënt). Zijn model van kwalitatieve overerving is nu wijd erkend. Het verklaart ziektebeelden als een hazenlip, hypertensie en Alzheimer. Multifactoriële of polygenetische ziektes komen vaak pas in het volwassen leven tevoorschijn.

Veel mutaties komen niet vanaf de geboorte voor, maar ontstaan door fouten in de mitose. Kanker is een voorbeeld van zo'n mutatie. Ook veroudering wordt op deze manier verklaard. Een paar termen hierbij zijn:

• Incidentie: hoe vaak in een bepaalde periode nieuwe ziektegevallen voorkomen
• Prevalentie: hoe vaak een ziekte op een bepaald moment in de populatie voorkomt
• Frequentie: heeft geen duidelijke definitie, maar wordt vaak als synoniem van incidentie gebruikt.
• Congenitaal: de ziekte is aangeboren en bij de geboorte al zichtbaar

Elements of medical genetics, hoofdstuk 2: Cellular and molecular basis of inheritance

Pagina 22-26

Mutaties zijn overerfbare veranderingen in het genetische materiaal. Ze zorgen voor evolutie, maar kunnen ook ziektes veroorzaken. Mutaties ontstaan soms door blootstelling aan mutagene stoffen, maar meestal zijn ze spontaan. Somatische mutaties worden niet aan het nageslacht doorgegeven, mutaties aan geslachtsklieren- en/of cellen wel. Mutaties komen veel voor, niet elke is direct schadelijk. Ook bestaat er 'terugmutatie', waarbij mensen die recessief homozygoot zijn voor een ziekte toch ook gezonde cellen hebben.

De meest voorkomende mutatie is substitutie: een nucleotide wordt vervangen door een andere. Als dit om hetzelfde type gaat, dus allebei pyrimidine (C en T) of allebei purine (A en G) heet het een transitie. Als een pyrimidine een purine wordt of andersom heet het een transversie. De transitie van C naar T komt het meest voor, omdat het complex tussen C en G (het CpG-complex) makkelijk muteert. Bij een deletie verdwijnt één of meerdere nucleotiden, bij een insertie komt er één of meerdere nucleotiden bij. Als dit geen drievoud is, veranderd het hele leesraam. Grote deleties of inserties kunnen ontstaan door verkeerde cross-overs.

Men spreekt van een dynamische mutatie wanneer een zich herhalende sequentie instabiel wordt naarmate deze langer wordt. Dit zie je bij een aantal ziektes (zie tabel 2.5 op blz. 24). Deze herhalingen kunnen ontstaan door fouten in cross-overs, zusterchromatiden-uitwisselingen of DNA-polymerase. Omdat drievoudige herhalingen per generatie langer worden, verklaren ze het plotseling opkomen van ziektes in gezonde families.

Bij een synonieme of stille mutatie verandert het eiwit niet, bij een niet-synonieme mutatie gebeurt dit wel. Het laatste komt minder vaak voor. Door een niet-synonieme mutatie wordt vaak de functie van het eiwit veranderd, wat tot ziekte of de dood kan leiden. Er zijn drie soorten niet-synonieme mutaties:

• Missense: hierbij wordt een aminozuur in het eiwit veranderd en daardoor soms ook de structuur van het eiwit. Als dit het geval is, heet dit een niet-conservatieve substitutie. De kwantitatieve functie blijft vaak hetzelfde, maar de kwalitatieve functie (optimale pH, stabiliteit) niet. Als de verandering van aminozuur geen effect op het eiwit heeft, noemen we het een conservatieve substitutie.
• Nonsense: hierbij leidt de substitutie tot de vorming van een stopcodon. Deze verkorte eiwitten kunnen vaak hun functie niet uitoefenen. Het 'nonsense-mediated decay'-proces breekt mRNA met vervroegde stopcodons af.
• Frameshift: hierbij is een insertie of deletie niet in drievoud en wordt het leesraam veranderd. Meestal komt hierbij ook een vervroegd stopcodon voor.

Mutaties in niet-coderend-DNA zijn alleen schadelijk als ze in een gebied zitten dat genexpressie regelt, zoals de promotor.

De gevolgen van mutaties zijn verlies of winst van functie. Verlies van de functie resulteert in een hypomorf eiwit als de functie is afgenomen, en een amorf eiwit als de functie compleet verloren is. Vaak zijn deze aandoeningen recessief.

Winst van functie leidt tot verschillende dominante ziektes, bij homozygoten is de ziekte vaak erger dan bij heterozygoten. Bij een dominante negatieve mutatie zorgt het gemuteerde gen dat het gezonde gen geen goed werkend eiwit meer maakt.

Vaak heeft een ziekte meerdere vormen. Door moleculaire genetica zijn fenotypes steeds beter te verklaren. Bepaalde genotypes worden ook aan bepaalde fenotypes gekoppeld. Dit heet genotype-fenotype correlatie. Bij veel ziektes wordt dit gebruikt om te kijken waar patiënten risico voor lopen.

Elements of medical genetics, hoofdstuk 7: Patterns of inheritance

Pagina 109-121, 126

Een belangrijke reden om het overervingpatroon van een ziekte binnen families te bestuderen is om te kijken wat het risico is op ziekten voor leden van die familie. Het tekenen van een stamboom begint met de persoon die bij de arts komt; dit noemen we de index case, proband of propositus. Zijn of haar positie in de stamboom wordt met een pijl aangegeven. Informatie over directe familie wordt gevraagd en ingetekend, let hierbij op de juiste familieband.

Aandoeningen op één gen noemen we unifactorieel of mendeliaans. Veel ziektes zijn echter multifactorieel. Als een ziekte door een fout op een geslachtschromosoom komt, noemen we het X-chromosomaal of geslachtsgebonden. Anders is het autosomaal.

Een dominante aandoening leidt al tot ziekte als een individu ook een gezond gen heeft en dus heterozygoot is. Zo'n ziekte is in alle generaties van een familie terug te vinden. Een kind van een ouder die heterozygoot voor een dominante ziekte is, heeft 50% kans deze ziekte ook te krijgen. Veel autosomale dominante ziektes zijn pleiotropisch, ze leiden tot meerdere, ongerelateerde effecten. Hierdoor kunnen individuen met dezelfde ziekte andere verschijnselen hebben. Soms is een individu met een mutatie zelfs helemaal normaal. Dit verschil in uiting van de ziekte heet variabele expressiviteit. Bij verminderde penetrantie is het mogelijk een individu een dominante autosomale ziekte heeft, maar dat deze zich niet uit. Dit individu heet dan non-penetrant en kan gezond zijn doordat andere genen of omgevingsfactoren de ziekte modificeren. De ziekte kan wel aan het nageslacht worden doorgegeven, dan lijkt het alsof de ziekte een generatie heeft overgeslagen.

Als een dominante ziekte opkomt in een familie waar deze niet voorkomt, spreken we van een nieuwe mutatie. Let hierbij ook op of de ouders wel echt de ouders zijn! Nieuwe mutaties komen vaak door een verhoogde leeftijd van de vader. Bij codominantie komen twee verschillende allelen tot uiting, een voorbeeld is bloedgroep AB. Als een individu homozygoot is voor een dominante aandoening, leidt dit soms tot verergering van de ziekte (dan is het dominante allel incompleet dominant) of de ziekte is even erg als bij heterozygote patiënten (het dominante allel is puur dominant).

Bij een recessieve aandoening zijn twee gemuteerde allelen nodig om de ziekte te krijgen, heterozygoten zijn drager van de ziekte. Het traceren van een recessieve aandoening in een stamboom is vaak moeilijk, vaak hebben broers en zussen van een patiënt de aandoening ook. Consanguïniteit (bloedverwantschap tussen ouders) leidt vaak tot kinderen met een zeldzame recessieve aandoeningen. Twee heterozygote ouders hebben 25% kans dat hun kind de aandoening heeft en 50% kans dat het kind ook drager van de ziekte is. Als een van de twee ouders homozygoot recessief is en de andere heterozygoot, dan is de kans dat het kind de ziekte heeft 50%. Omdat dit een even grote kans is als bij een dominante ziekte, noemen we dit pseudodominant.

Bij locus-heterogeniteit leiden meerdere defecten tot dezelfde ziekte, dit is het geval bij doofheid. Omdat twee dove ouders dit door verschillende mutaties kunnen hebben, is er een kans dat de kinderen wel kunnen horen. Dit noemen we dan dubbele heterozygoten. Ziektes waarbij meerdere gemuteerde genen tot hetzelfde resultaat leiden noemen we genokopieën. Als milieufactoren hier ook tot kunnen leiden, noemen we de ziektes fenokopieën.

Ook bestaat het dat twee mutaties op hetzelfde locus tot dezelfde ziekte leiden, dit noemen we compound heterozygoot of mutationeel heterozygoot. Dit komt veel vaker voor dan pure homozygotie.

Genen op het X-chromosoom noemen we X-linked, genen op het Y-chromosoom heten Y-linked of holandrisch. Aandoeningen op het X-chromosoom komen voornamelijk voor bij mannen, omdat zij maar één X-chromosoom hebben. Een man met een mutant X-chromosoom noemen we hemizygoot. Omdat zo'n ziekte meestal niet zichtbaar wordt bij vrouwen, heeft het een diagonaal patroon in een stamboom. De dochters van een man met een X-chromosomale afwijking zullen allen drager zijn (obligaat dragerschap), de zonen allen gezond (behalve bij uniparentale heterodisomie). De zonen van een moeder die drager is hebben 50% kans op de ziekte, de dochters hebben 50% kans op dragerschap. Sommige X-chromosomale afwijkingen, zoals Duchenne, leiden tot vroege sterfte, waardoor de overerving alleen via draagsters en nieuwe mutaties gaat. Omdat vrouwen mozaïek zijn voor het X-chromosoom, zijn zij dit ook voor deze ziektes. Ook kunnen vrouwen homozygoot recessief zijn, vooral bij ziektes die vaak voorkomen, zoals kleurenblindheid.

Dominante aandoeningen op het X-chromosoom komen weinig voor, vitamine D resistentie is een voorbeeld. Alle dochters van een man met zo'n ziekte krijgen de aandoening, en geen van zijn zonen. Ondanks dat zowel mannen als vrouwen evenveel kans hebben, zijn sommige ziektes minder erg bij vrouwen. Omdat vrouwen mozaïsch zijn voor het X-chromosoom, komt het voor dat heterozygote vrouwen in sommige delen van hun lichaam een dominante X-chromosomale aandoening niet vertonen. Dit komt omdat in deze gebieden het gezonde X-chromosoom actief is.

Y-linked aandoeningen zijn altijd dominant, want er is maar één Y-chromosoom. Deze aandoeningen worden alleen van vader op zoon doorgegeven.

Sommige aandoeningen lijken autosomaal over te erven, maar liggen toch op de geslachtschromosomen. Dit komt doordat het X- en het Y-chromosoom een regio delen, de pseudoautosomale regio. Door crossing-over kan een stuk van een gemuteerd X-chromosoom op het Y-chromosoom komen te liggen, een man kan de aandoening zo ook aan zijn zoon geven. Zulke aandoeningen worden in de ene familie als dominant autosomaal gerapporteerd, en in de andere als X-linked.

Ook komen sommige autosomale aandoeningen bij het ene geslacht vaker tot uiting dan bij het andere, een voorbeeld hiervan is kaalheid. Dit komt omdat mannen en vrouwen hormonaal van elkaar verschillen. Dit heet sex influence. Bij Sex limitation komt een aandoening maar bij één geslacht voor.

Een handig schema over de verschillende manieren van overervingen is Box 7.1 op blz. 118. Hier staat mitochondrieel overerven, dat alleen via de moeder gebeurt, niet tussen.

Van anticipatie  is sprake als een ziekte op jongere leeftijd tot uiting komt bij een volgende generatie, of als de ziekte in de volgende generatie erger is. Er zijn hier vele theorieën over, maar bij een aantal ziektes is duidelijk geworden dat het komt doordat een bepaalde sequentie steeds langer wordt. Hoe langer de sequentie, hoe instabieler het te maken eiwit en hoe erger de ziekte. Bij myotone dystrofie is dit het geval bij het CTG-triplet, dat tijdens de maternale meiose verlengd kan worden. Bij Huntington is dit het geval tijdens de paternale meiose.

Mozaïcisme houdt in dat een individu of een weefsel meerdere typen cellijnen heeft. Dit komt door een fout in de mitose na de conceptie. Een deel van de cellen ontwikkelt zich dan met een mutatie. Er zijn twee vormen mozaïcisme: somatisch en gonadaal.

Bij somatisch mozaïcisme heeft een individu minder last van een ziekte dan andere individuen met de ziekte, of komt de ziekte slechts in een of enkele regio's van het lichaam voor. Als de mutatie niet in de geslachtscellen voorkomt, kan het niet worden doorgegeven aan het nageslacht. Bij gonadaal mozaïcisme zit de mutatie alleen in de geslachtscellen, en wordt de ziekte dus doorgegeven al zijn beide ouders gezond.

Van uniparentale disomie spreekt men als een kind niet van beide ouders één chromosoom erft, maar van één ouder twee chromosomen. Als dit hetzelfde chromosoom is, zit de fout in meiose II en noemen we het uniparentale isodisomie. Krijgt het kind twee verschillende chromosomen van dezelfde ouder, dan zit de fout in meiose I en noemen we het uniparentale heterodisomie. Beide gevallen leiden tot een trisomie, een van de chromosomen wordt afgestaan om toch een normale hoeveelheid chromosomen te hebben. In een op drie gevallen ontstaat zo een uniparentale disomie. Uniparentale disomie kan ook redding betekenen, als de andere geslachtscel nullosomisch is.

Iedere cel bevat mitochondrieel DNA, vooral cellen die veel energie nodig. Mitochondrieel DNA wordt compleet overgeërfd van de moeder, via de oöcyt. Mitochondriële overerving  wordt gezien als mogelijke verklaring voor ziekten die bij zowel mannen als vrouwen voorkomen, maar alleen worden doorgegeven via vrouwen. Omdat mitochondriën een belangrijke rol hebben bij celmetabolisme, zijn de weefsels die het gevoeligst zijn voor mitochondriële mutaties het centrale zenuwstelsel, de skeletspieren en het hart. Normaal gesproken is het DNA van de verschillende mitochondriën identiek, dit wordt homoplasmie genoemd. Als er ergens een mutatie optreedt, zullen er twee populaties van mitochondrieel DNA zijn, heteroplasmie.

Elements of medical genetics, hoofdstuk 8: Population and mathematical genetics

Pagina 129-132

In een grote, willekeurig voortplantende populatie waar geen verstorende invloeden van buitenaf zijn, blijven de relatieve aantallen van verschillende genotypen constant van generatie op generatie. Dit staat bekent als het Hardy-Weinberg principe. Als je een locus hebt met twee mogelijke allelen, A en a, hebben deze als frequentie respectievelijk p en q. Hierbij hoort de volgende tabel:

Dit hoort bij een ideale populatie. Voor sommige menselijke eigenschappen, zoals genen van bloedgroepen, kan Hardy-Weinberg worden toegepast. Een aantal factoren die ervoor zorgen dat de Hardy-Weinbergregel niet op gaat zijn:

• onwillekeurige partnerkeuze
• mutatie
• selectie
• kleine populatie
• gene flow (migratie)

Wijdverspreid bloedverwantschap in een gemeenschap (voortplanting van twee mensen met een gemeenschappelijke voorouder) leidt tot een relatieve toename van de frequentie van aangedane homozygoten en een afname van heterozygoten.

Bij X-linked recessieve aandoeningen is de frequentie van aangedane mannen gelijk aan de frequentie van het mutante allel (q). Aangedane vrouwen zijn dan gelijk aan q²  en vrouwelijke dragers aan 2pq.

Enkele formules die bij dit principe gebruikt worden zijn:

p + q = 1

p²   + 2pq + q²  = 1

Als de incidentie van een autosomaal recessieve aandoening bekend is, kan daarmee de dragerschapsfrequentie worden uitgerekend.

Een voorbeeld:

De incidentie van een recessief allel is 1/10.000, dus q² is 1/10.000.

q is dan de wortel van q², dus 1/100.

p + q = 1, dus p is in dit geval 99/100.

Dragers hebben als genotype 2pq, dus 2 x 1/100 x 99/100.

In deze populatie is dus ongeveer 1 op de 50 mensen drager van dit allel.

Elements of medical genetics, hoofdstuk 9: Polygenic and multifactorial inheritance

Pagina 143-144, 147-150

Bij multifactoriële overerving spelen verschillende factoren, zowel in de genen als in de omgeving, een rol in het veroorzaken van aandoeningen. Genen die samen verantwoordelijk zijn voor een bepaalde eigenschap, worden polygenen genoemd. Het gaat dan bijvoorbeeld om bloeddruk of lengte. Bij polygene overerving gaat het om de overerving en expressie van een fenotype dat is vastgelegd door verschillende genen op verschillende loci, die allemaal een eigen bijdrage leveren. Hier dragen alle genen evenveel bij.

Het International HapMap project identificeert SNP frequenties en haplotypes (gelinkte SNP frequenties) in verschillende populaties. De HapMap databank wordt steeds uitgebreider, waardoor er meer studie mogelijk is over SNP genotypering. Een SNP is een variatie in het menselijke genoom, deze zorgen voor de variatie tussen de mensen.

Bij een genome-wide association (GWA) studie vergelijken onderzoekers varianten van het gehele genoom in een case control studie. Met deze nieuwe methode zijn er veel verbanden gevonden tussen SNP’s en bepaalde ziektes. Een groot voordeel van de GWA studies is dat ze “hypothese-vrij” zijn, er is van tevoren geen veronderstelling over of de genen bij een bepaalde ziekte betrokken zouden kunnen zijn.

Het Thousand Genomes Project is een nieuw initiatief op grote schaal, met als doel om meer variatie in menselijke genen in kaart te brengen. Hiervoor wordt sequencing gedaan van het genoom van 1000 verschillende mensen van over de hele wereld. Hiermee hoopt men meer inzicht te krijgen in de genen die betrokken zijn bij multifactoriële ziektes.

Elements of medical genetics, hoofdstuk 17: Genetic counseling

Pagina 269-270

Van consanguïniteit wordt gesproken bij een huwelijk tussen twee mensen die tenminste één gemeenschappelijke voorvader hebben, niet verder weg dan een over-over-grootouder. In sommige delen van de wereld, bijvoorbeeld in Arabische landen en ook in India, zijn dit soort huwelijken veelvoorkomend. Vaak is er wel enig besef van mogelijke nadelen, maar wegen de sociale voordelen veel zwaarder voor deze mensen.

Veel studies laten zien dat er een hogere incidentie is van zowel congenitale aandoeningen als aandoeningen die later optreden bij kinderen van bloedverwanten. Dit komt bijna allemaal voort uit het feit dat een kind een grotere kans heeft op homozygotie voor een autosomaal recessieve stoornis. Bij volle neven en nichten is de kans dat een kind homozygoot zal zijn voor een bepaalde autosomaal recessieve aandoening afkomstig van de grootouders 1 op 32. Daarnaast is er ook nog het standaard risico van 1 op 40 dat een kind een grote congenitale abnormaliteit heeft. Dit geeft een overall risico van 1 op 20 voor kinderen van neven en nichten op een handicap. Voor bloedverwanten die minder nauw verwant zijn, is het risico lager.

Incestueuze relaties zijn relaties tussen eerstegraads bloedverwanten (broer-zus, ouder-kind). Dit is officieel verboden in bijna iedere cultuur. Het risico op kinderen met abnormaliteiten is heel hoog. Minder dan de helft van de kinderen die hieruit voortkomen is gezond.

Elements of medical genetics, hoofdstuk 22: Risk calculation

Pagina 340-344

Wanneer bij iemand in de familie een autosomaal dominante ziekte heerst, is er 50% kans dat kinderen van die ouders deze ziekte ook krijgen. Om deze kans goed te berekenen moet er een duidelijke familiegeschiedenis bekend zijn, er moet bekend zijn of er een volledige penetrantie is en er moet betrouwbare informatie zijn over de diagnose van heterozygoten. Het is namelijk belangrijk om te weten of de zieke van een ouder is overgeërfd of dat deze is ontstaan door een mutatie. Als er bepaalde dingen niet bekend zijn, of niet juist bekend zijn, wordt de berekening van de kans moeilijker.

Penetrantie wordt meestal weergeven in de vorm van een percentage. 80% penetrantie wil zeggen dat bij 80% van alle mensen met ten minste één mutant allel de ziekte tot expressie komt. Dit kan ook worden weergeven als P=0.8. Mensen zijn die wel het mutante allel hebben, maar bij wie dit niet tot uiting komt, heet gereduceerde penetrantie.

Voorbeeld uit het boek: een vrouw heeft dominante ziekte, met een penetrantie van 0.8. Het risico dat een kind van deze vrouw de ziekte zal ontwikkelen is: ½ x 0.8 = 0.4.

Het wordt echter lastiger als er een berekening gemaakt moet worden voor toekomstige kinderen van bepaalde mensen, diegene zelf is gezond maar de ouders waren ziek. Deze kans kan als volgt berekend worden:

Er worden 10 kinderen verwekt, de penetrantie is 0.8. 5 van de 10 kinderen zullen de ziekte waarschijnlijk krijgen. Maar omdat de penetrantie 0.8 is zullen maar bij 4 van de 5 kinderen de ziekte tot uiting komen. Hierdoor zullen 6 van de 10 kinderen de ziekte niet hebben. Dat kans dat een niet zieke kind wel de drager is van de ziekte 1/8. De kans dat deze persoon een kind krijgt dat ziek wordt is dus 1/8 x ½ x 4/5.

Omdat autosomale ziektes vaak op latere leeftijd tot uiting komen is het belangrijk voor dragers te weten of ze de ziekte nog krijgen of door kunnen geven aan hun kinderen. Het is belangrijk dit dus ook te kunnen berekenen, hierbij wordt de Hardy-Weinberg formule gebruikt.

Een autosomale recessieve ziekte is een ziekte waarbij de ouders van een kind niet ziek zijn, maar beide heterozygoot zijn (of 1 van de ouders is heterozygoot en er vindt een mutatie plaats). Hun kind is echter wel ziek. De ziekte wordt vaak ook niet verder doorgegeven en komt maar in 1 generatie voor. Een kind heeft ¼ kans om de ziekte ‘volledig’ te krijgen. De kans om een drager van een autosomale recessieve te zijn, is ⅔ omdat 2 van de 3 gezonde kinderen wel het gen bevatten.

Thema III: DNA-replicatie, -transcriptie, -repair en –recombinatie

Essential cell biology, hoofdstuk 6: DNA replication, repair and recombination

Pagina 197-199, 203-221

Of een cel kan overleven hangt af van hoe accuraat de DNA-replicatie plaatsvindt, dat gebeurt voor de celdeling. De controle en reparatie van het DNA bij schade zowel van buitenaf (chemicaliën en straling) als van binnen in de cel, speelt een belangrijke rol. Dit wordt gedaan door bepaalde eiwitten. Ondanks deze mechanismen komen fouten in het DNA soms voor.  Deze kunnen voordelig zijn (dankzij mutaties is evolutie en variatie tussen individuen mogelijk) maar kunnen ook negatieve gevolgen hebben, zoals aangeboren afwijkingen en kanker. Het streven is dus om te dupliceren met zo min mogelijk mutaties.

Replicatie gaat erg snel (1.000 nucleotideparen per seconde bij mensen) en gebeurt aan beide strengen van de dubbele helix. De stengen gaan uit elkaar en worden beiden gecomplementeerd met nucleotiden, wat mogelijk is omdat er vaste basenparen zijn: A-T en C-G. Om dit snel en accuraat te doen werken veel eiwitten samen, dit noemen we de replicatiemachine. Het eindresultaat van de replicatie noemen we semiconservatief, omdat beide gevormde dubbelstrengen uit een 'oude' en een 'nieuwe' streng bestaan.

De dubbele helix is erg stabiel door de waterstofbruggen en gaat alleen kapot bij temperaturen tegen de 100 graden. Voor replicatie is het uit elkaar gaan van de strengen ook nodig, dit gebeurt door de waterstofbruggen, die apart niet sterk zijn, één voor één te verbreken. De opening van de dubbele helix begint bij het zogenaamde 'origin of replication', wat door een bepaalde nucleotidevolgorde is aangegeven. Omdat de A-T band maar uit 2 waterstofbruggen bestaat is hij makkelijker te verbreken, de origin of replication bevat dan ook veel A-T banden. Het genoom van bacteriën heeft ronde DNA-moleculen en slechts één origin of replication, het menselijk genoom is veel groter en heeft er ongeveer 10.000. Replicatie begint dus op meerdere plekken tegelijk. Nadat de helix is geopend worden bepaalde eiwitten aangetrokken die voor de verdere replicatie zorgen.

DNA-replicatie vindt plaats in Y-vormige replicatievorken. Over deze vork glijden de eiwitten die de helix openen en de strengen als mal gebruiken om nieuwe strengen te vormen. Vanaf de origin of replication ontstaan er twee van deze vorken, die in tegengestelde richting gaan. Dit gaat bij mensen langzamer dan bij bacteriën, omdat replicatie van menselijke chromatiden ingewikkelder is. Het enzym DNA-polymerase plakt complementerende nucleotiden aan de losgemaakte streng, het staat dus aan de basis van de replicatie. Het katalyseert de binding van het 3'-einde van de ene nucleotide aan het 5'-einde van een nieuwe nucleotide. Deze nieuwe nucleotide is eerst een trifosfaatnucleoside, maar hij verliest twee van zijn fosfaatgroepen om energie voor de nieuwe binding te krijgen. Omdat de twee fosfaatgroepen (samen pyrofosfaat) afgebroken worden tot twee aparte fosfaatgroepen (P_i) is de polymerisatie van de nucleotiden vrijwel onomkeerbaar. Na het binden van de nucleotiden laat DNA-polymerase niet los maar beweegt het zich over de template streng waarbij het veel polymerisatie veroorzaakt.

Omdat de nieuwe nucleotiden aan het 3'-einde van de al vastgezette nucleotiden worden gebonden, gaat de groei van de nieuwe streng van 5' naar 3'. Dit levert een probleem op, want de ene template streng loopt zelf van 5' naar 3'. Als hier de nucleotiden direct aan worden gezet, zou dit van 3' naar 5' moeten en dat kan niet. Omdat er geen enzym is dat van 3' naar 5' kan synthetiseren, wordt deze streng in stukjes aangebouwd, telkens als er een groot genoeg stuk van de streng is opengebroken wordt er van 5' naar 3' (op de template streng dus van 3' naar 5') een nieuw stukje DNA aangebouwd. Deze kleine stukjes DNA noemen we Okazaki-fragmenten. De streng die op deze manier wordt gesynthetiseerd noemen we de 'lagging strand', de streng die aaneensluitend wordt gesynthetiseerd heet de 'leading strand'.

DNA-polymerase is erg accuraat, maar af en toe zit er een fout in de replicatie. Dit is mede doordat incorrecte baseparen (zoals G-T) niet stabiel zijn en uit elkaar vallen. Ook heeft het DNA-polymerase twee controlerende functies: ten eerste controleert het of de basen bij elkaar passen voor het de polymerisatie in gang zet en ten tweede doet het een proeflezing. Deze proeflezing houdt in dat DNA-polymerase pas aan de volgende nucleotide begint als het vorige basenpaar is goedgekeurd en vindt dus tegelijk met de synthese plaats. Als het vorige basenpaar niet klopt, knipt DNA-polymerase de foutieve nucleotide weg en zet het een andere, wel kloppende, ervoor in de plaats. De proeflezing gaat terug en is daarom van 3' naar 5', dit is ook de reden dat DNA-polymerase alleen van 5' naar 3' kan synthetiseren: anders is de proeflezing niet mogelijk.

DNA-polymerase kan alleen een nucleotide aanhechten aan een al gevormde streng en kan dus niet zomaar beginnen met de replicatie. Er is een enzym nodig dat uit het niets twee nucleotiden kan binden. Dit enzym heet primase, maar hecht geen DNA maar RNA, het is dan ook een RNA-polymerase. Een streng van ongeveer 10 nucleotiden RNA wordt gevormd als begin (primer) voor de replicatie, deze primer is complementair aan de template streng. RNA lijkt erg op DNA maar heeft twee OH-groepen aan de suiker in plaats van één (daarom heet het ribose en niet deoxyribose) en heeft in plaats van de base thymine, de base uracil, deze blijft complementair aan adenine. In de leading strand is er maar een RNA-polymerase nodig omdat de replicatie continu is, bij de lagging strand is er voor elk Okazaki-fragment een nieuwe RNA-polymerase nodig. Om toch één streng DNA te vormen, zijn drie enzymen nodig. Een verwijdert de RNA-primer, een ander vult het nu lege stuk met complementair DNA waarbij het een Okazaki-fragment als begin neemt en een derde enzym hecht dit nieuwe stuk DNA aan de streng.

Primase kan dus vanuit het niets beginnen met het opbouwen van een RNA-streng en kan daardoor niet proeflezen, waardoor er in de primers vaak mutaties zitten. Omdat de primers toch worden vervangen door DNA maakt dit niet uit.

Het eiwit helicase gebruikt ATP om de dubbele helix open te breken en zogenoemde 'single-strand binding proteins' koppelen snel aan de gevormde enkele strengen om te voorkomen dat deze weer aan elkaar hechten. Een ander eiwit, 'sliding clamp' genoemd, vormt een ring achter DNA-polymerase en zorgt ervoor dat deze op de streng blijft zitten tijdens de replicatie. Een eiwit genaamd 'clamp loader' zorgt door middel van de hydrolyse van ATP ervoor dat de sliding clamp zich om het DNA hecht. Op de leading strand is dit maar een keer, maar op de lagging strand is voor elk Okazaki-fragment een nieuwe aanhechting nodig.

De meeste eiwitten van het replicatieproces zijn verbonden in een multi-enzymaal complex wat voor een gecoördineerde replicatie zorgt. Hoe de eiwitten in het complex precies samenwerken is nog niet helemaal duidelijk.

De einden van chromosomen vormen een probleem voor het DNA-polymerase, hier is geen plaats om een RNA-primer aan te hechten en dus kan het uiterste topje niet op de normale manier gekopieerd worden. Om verlies van DNA te voorkomen trekt het einde van het chromosoom, het telomeer, een bepaald enzym aan, telomerase. Dit bevat een deel RNA waar het korte, repeterende DNA-fragment aan bindt. DNA-polymerase kan dit als een primer gebruiken en zo toch de hele streng kopiëren. Het feit dat telomeren uit repeterende stukjes DNA bestaan wordt door de cel gebruikt om te controleren of een chromatide wel twee goede uiteinden heeft en er geen dubbelstrengsbreuk heeft plaatsgevonden.

De meeste mutaties worden meteen rechtgezet door een aantal processen, gezamenlijk 'DNA repair' genoemd. Soms blijven mutaties echter bestaan en worden ze ook doorgegeven aan dochtercellen, dat kan grote gevolgen hebben. Een kleine mutatie in slechts één basenpaar kan al leiden tot ernstige gezondheidsschade. Dit komt doordat de basen coderen voor aminozuren, die weer eiwitten vormen. Eén verkeerd aminozuur kan leiden tot verandering of uitval van de functie van een eiwit. Zowel voor geslachtscellen als voor somatische cellen is bescherming tegen mutaties erg belangrijk. Mutaties in geslachtscellen kunnen worden doorgegeven aan het nageslacht, mutaties in somatische cellen kan leiden tot gezondheidsschade van het individu.

Ondanks de controles door DNA-polymerase zijn er toch soms nog fouten in de DNA-replicatie. Hiervoor is een extra controle systeem, het mismatch-repair-systeem (een mismatch is een niet-complementair basenpaar en dus een kopieerfout). DNA-polymerase maakt in ongeveer één op 10⁷ basenparen een fout. Het mismatch-repair-systeem repareert 99% van deze fouten, waardoor het aantal fouten nog maar één op de 10⁹ basenparen is. Het mismatch-repair-systeem knipt de base van de nieuwe streng weg, waarna het door een nieuwe, wel complementaire, base wordt vervangen. Als dit met de oude streng zou gebeuren, zou de fout niet hersteld maar juist verdubbeld worden. Waarschijnlijk is de nieuwe DNA-streng te herkennen aan breuken in het enkelstrengs DNA, die signalen naar het mismatch-repair-mechanisme sturen. Mismatch repair is belangrijk voor de preventie van kanker. Sommige erfelijke ziektes zorgen voor een fout in dit systeem, de patiënten hebben dan vaak een vorm van kanker.

Andere schade die voorkomt in het DNA, is depurinatie, waarbij adenine en guanine losbreken uit de DNA-streng, en deaminatie, waarbij de NH₂-groep in cytocine wordt vervangen door een O en er uracil, ontstaat. Chemische reacties in de cel kunnen ook het DNA aantasten. Een voorbeeld is Uv-straling, wat kan leiden tot bindingen tussen pyrimidines.

De meeste reparaties zijn gebaseerd op het feit dat er twee kopieën van het genoom zijn, er zijn immers twee complementaire strengen DNA. Het repareren van de schade gaat in drie standaard stappen. De eerste stap is het herkennen en verwijderen van fouten in het DNA, dit gebeurt door verschillende mechanismes. Hierdoor ontstaat er een klein gat in het DNA. De tweede stap is het binden van reparatie-DNA-polymerase aan het 3'-uiteinde van het gat, waarna een nieuwe, complementaire base wordt ingebouwd. Dit werkt hetzelfde als normaal DNA-polymerase en is vaak dezelfde DNA-polymerase die de gaten die RNA-primers achterlaten opvult. De derde stap is het hechten van de nieuwe nucleotide aan de andere helft van de streng door ligase. Stap 2 en 3 zijn vrijwel identiek aan replicatie, maar voor stap 1 zijn veel verschillende enzymen nodig, elk gespecialiseerd voor een bepaalde soort mutatie. Cellen bevatten dus veel reparatiemechanismes, als er eentje uitvalt kunnen de gevolgen zwaar zijn.

Bij dubbelstrengsbreuken is er geen complementair materiaal om mee te repareren, en de gevolgen zijn groot omdat bij celdeling stukken DNA verloren gaan. De meeste van deze breuken worden gerepareerd door een mechanisme genaamd  'nonhomologous end-joining'. Het herkent stukken DNA die niet aan beide kanten telomeer hebben en zet deze aan elkaar. Omdat niet elk deel van het DNA codeert, maakt het vaak niet uit dat hierbij DNA verloren gaat.

Bij homologe recombinatie wordt een nieuw stuk DNA gevormd om de dubbele streng te repareren. Het maakt gebruik van DNA-moleculen die identiek zijn aan de kapotte DNA-streng,  namelijk dat van de zusterchromatide. Homologe recombinatie zorgt tijdens de meiose ook voor variatie, omdat het zorgt dat paternale en maternale chromosomen stukken van hun DNA uitwisselen, waardoor nieuwe en misschien wel betere combinaties van genen ontstaan. De mechanismes van reparatie van dubbelstrengsbreuken en deze uitwisseling komen op veel aspecten overeen.

Omdat DNA-replicatie zo accuraat is, en de mutaties die slecht voor de gezondheid zijn vaak tot onvruchtbaarheid of zelfs vroege sterfte leiden, is de genetische code al tientallen miljoenen jaren behouden. Het komt hierdoor dat het menselijk genoom erg veel overeenkomt met dat van dieren.

Essential cell biology, hoofdstuk 7: From DNA to protein

Pagina 231-246

Het DNA codeert voor eiwitten, de belangrijkste bouwstenen van de cel, die de structuur en functie van de cel bepalen. Eiwitten verschillen van elkaar doordat de volgorde van de aminozuren waaruit ze zijn opgebouwd altijd anders is. Dit geeft het eiwit een eigen vorm. Omdat er zoveel verschillende combinaties van aminozuurketens zijn, bestaan er ook duizenden verschillende eiwitten.

Als er een bepaald eiwit gemaakt moet worden, wordt eerst het benodigde deel van het DNA overgeschreven op RNA, dit heet transcriptie. Het maken van een eiwit met behulp van informatie van het RNA heet translatie. Ook komt RNA-splicing voor, waarbij stukjes uit het RNA worden geknipt en de sequentie van de aminozuren verandert. De stap van DNA naar RNA naar eiwit heet het centrale dogma, omdat cellen in alle organismes dit doen.

Transcriptie en translatie zijn de manieren waarop de cel zijn genen tot expressie brengt. Een stuk DNA kan vele malen worden getranscribeerd en dus vele stukjes RNA vormen, en een stukje RNA kan meerdere eiwitten maken. Zo kan de cel met maar twee kopieën van het DNA toch in korte tijd veel eiwitten maken. Omdat de snelheid en kwantiteit van het aflezen per stuk DNA verschilt, worden er van sommige eiwitten meer kopieën gemaakt dan van andere. De expressie van elk gen kan door de cel worden aangepast.

De productie van RNA, de transcriptie, is de eerste stap in de genexpressie. RNA verschilt van DNA doordat het ribose in plaats van deoxyribose bevat, het uracil als complementaire base voor adenine heeft in plaats van thymine en het enkelstrengs is en dus geen dubbele helix heeft. Omdat RNA enkelstrengs is, kan het ook op veel manieren gevouwen worden, waardoor het naast de functie om eiwitten te produceren ook structurele en katalytische functies kan hebben.

Transcriptie begint met het openen van de dubbele helix, waarna één van de strengen als template streng dient voor het RNA. Het aangroeien van RNA is vergelijkbaar met DNA-replicatie, een nucleotide die complementair is aan de base in de DNA-streng wordt gezocht en aangehecht. Het transscript is dus complementair aan de template streng. Het RNA vormt geen waterstofbruggen met het DNA en zodra een base goed is aangehecht, maakt het RNA ruimte voor de dubbele helix om weer aaneen te sluiten zodat het DNA niet lang geopend is. RNA is in vergelijking met DNA erg kort, het bevat maximaal slechts enkele duizendtallen aan nucleotiden.

De transcriptie wordt geleid door een enzym dat RNA-polymerase heet, dit zorgt voor de di-esterbinding van fosfaat en vormt de 'ruggengraatstructuur' van suikers en fosfaten die het RNA bevat. RNA-polymerase beweegt langzaam over de template streng, waarbij het kleine stukjes van de dubbele helix openbreekt en dan de template streng complementeert. Hierbij gebruikt het de energie van de ribonucleaire trifosfaten (ATP, UTP, CTP en GTP). Omdat RNA vrijwel meteen de template streng weer loslaat kan hetzelfde gen in kortere tijd vaak getranscribeerd worden. Transcriptie gaat sowieso erg snel, een gemiddeld RNA-molecuul bestaat uit ongeveer 1500 nucleotiden en wordt in 50 seconden gevormd.

De verschillen tussen RNA-polymerase en DNA-polymerase zijn dat RNA-polymerase ribosenucleotiden aan elkaar hecht in plaats van deoxyribosen, en dat RNA-polymerase zonder primer kan beginnen met de vorming van een streng. Dit laatste heeft ermee te maken dat RNA-polymerase geen controlerende functie heeft zoals DNA-polymerase, dit is ook niet nodig want fouten in het RNA hebben veel minder consequenties dan fouten in het DNA.

In de cel bevinden zich meerdere soorten RNA. Het RNA dat getranscribeerd wordt en dus voor aminozuren codeert, noemen we mRNA (messenger-RNA). Andere soorten RNA hebben een structurele functie of helpen bij de translatie, zoals rRNA (ribosomaal-RNA), dat het grootste deel van de ribosomen vormt en tRNA (transfer-RNA), dat de aminozuren levert waar de ribosomen het eiwit van maken. Er bestaat ook miRNA (micro-RNA) dat helpt bij de genexpressie, en andere RNA-vormen voor bijvoorbeeld RNA-splicing.

Het beginpunt van de transcriptie is bij bacteriën een bepaalde basenvolgorde in het DNA, de promotor genoemd. Hier wordt de dubbele helix geopend en dient een van de stengen als template streng. Transcriptie gaat door tot het een bepaalde basenvolgorde, de terminator, tegenkomt, waarbij RNA-polymerase zowel de template streng als het gevormde RNA loslaat. De herkenning van de promotor wordt gedaan door een deel van het bacteriële polymerase, de sigmafactor, welke na transcriptie van een aantal nucleotiden loslaat. Als de polymerase de template streng loslaat, bindt het weer met zo'n sigmafactor en kan het een volgend deel van het DNA transcriberen. Ondanks dat de promotor de dubbele streng opent en dus twee strengen als template streng zouden kunnen dienen, wordt maar in één richting op één van de strengen getranscribeerd, dit omdat het RNA-polymerase maar op een streng wordt vastgehecht en er alleen in de 5'- naar 3'-richting nieuwe nucleotiden verbonden kunnen worden. De streng waarop getranscribeerd wordt, verschilt per gen.

Transcriptie in eukaryoten lijkt op transcriptie in bacteriën, maar er zijn essentiële verschillen. Ten eerste hebben eukaryoten drie soorten RNA-polymerase in plaats van één. Polymerasen I en III zorgen voor het niet-coderende RNA zoals rRNA en tRNA, RNA polymerase II zorgt voor het mRNA en wordt meestal gewoon RNA-polymerase genoemd. Daarnaast is er voor transcriptie in een eukaryote cel een collectie helpende eiwitten nodig, deze heten de general transcription factors. Ook liggen bij de eukaryoten de coderende delen van het DNA verder uit elkaar en zijn er veel complexere vormen van transcriptie mogelijk. Als laatste is het DNA van eukaryoten veel beter verpakt en moeilijker af te lezen dan bacterieel DNA.

De general transcription factors verzamelen rond de promotor, helpen bij het aanhechten van RNA-polymerase, openen de dubbele helix en zetten RNA-polymerase in werking. Eerst hecht het zogenoemde TFIIB (vanwege zijn vele A's en T's ook wel de TATA box genoemd) aan de promotor (ongeveer 25 nucleotiden voor het beginpunt van de transcriptie), de promotor valt nu meer op. Hier komen de andere factoren en RNA-polymerase II op af en wordt het transcription initiatie proces gevormd. Voor RNA-polymerase met de transcriptie kan beginnen, moet het uit dit proces losraken. Dit gebeurt door fosfaatgroepen aan de staart van polymerase te koppelen met behulp van kinase, een enzym van factor TFIIH. Als de transcriptie in gang is gezet laten de meeste general transcription factors de streng los om elders een andere transcriptie te beginnen. Na de transcriptie laat ook RNA-polymerase los en worden de fosfaatgroepen eraf gehaald door fosfatase en kan het aan een andere transcriptie beginnen.

In bacteriën wordt het mRNA in het cytoplasma gevormd en kan translatie door de ribosomen meteen plaatsvinden. In eukaryoten bevindt het RNA zich in de nucleus, en voor het hieruit kan, vinden nog wat bewerkingen plaats, wat RNA processing heet. Deze bewerkingen vinden tegelijk met de transcriptie plaats. Verschillende RNA-soorten hebben verschillende processen, kenmerkend voor mRNA zijn capping en polyadenylation. Capping houdt in dat aan het 5'-einde een guaninenucleotide met een methylgroep wordt gekoppeld als er ongeveer 25 nucleotiden zijn aangebouwd en bij polyadenylation wordt het RNA-molecuul op een bepaalde plek afgeknipt en wordt aan het 3'-einde een keten van enkele honderden adeninenucleotiden gehecht. Beide zijn om het mRNA te stabiliseren, te helpen bij het transport naar het cytoplasma en om het mRNA te kenmerken. Daarbij is hieraan te zien of het mRNA compleet is, omdat zowel het begin als het eind worden gemarkeerd.

Alle soorten RNA van eukaryoten bevatten delen die niet coderen, de introns genoemd, die meestal langer zijn dan de wel coderende delen, de exonen. RNA-splicing knipt deze introns uit het RNA, hierbij maakt het gebruik van bepaalde volgorden van de introns die aangeven dat het een intron is. Deze volgordes zitten tegen de einden van de introns aan en zijn vrijwel identiek in alle introns. Nadat introns zijn losgeknipt, vormen ze een soort lus. De splicing wordt niet zoals de meeste stappen door enzymen uitgevoerd, maar door andere RNA-moleculen. Bepaalde RNA-moleculen herkennen de grens tussen exon en intron en bevatten bepaalde eiwitten. Deze eiwitten vormen de kern van spliceosomes, dit zijn grote verzamelingen RNA en eiwitten en zorgen voor de splicing. Doordat splicing optreedt, kan een transcript op verschillende manieren in elkaar worden gezet en dus verschillende eiwitten produceren, dit noemen we alternatieve splicing. Daarbij zorgen introns ook voor snellere recombinatie tussen verschillende genen en dus voor de evolutie van eiwitten.

Het hebben van introns heeft ook een nadeel, het genoom is veel langer dan als het alleen exonen zou bevatten. Hierdoor kunnen prokaryoten, die geen introns hebben, veel sneller delen dan eukaryoten. Of introns altijd al bestonden maar door prokaryoten uit het genoom zijn gestoten of dat introns overblijfselen van parasitair genetisch materiaal zijn, is niet duidelijk.

Alleen correct gevormd, volwassen RNA kan van de nucleus naar het cytoplasma. Hiervoor zorgt het nucleaire porie complex, gaten waardoor macromoleculen de nucleus in en uit kunnen. Verschillende eiwitten, zoals het 'cap-binding complex', 'poly-A-binding proteins' en een markering voor splicing geven aan dat alle stappen zijn doorlopen. Het RNA dat achterblijft wordt afgebroken.

Omdat mRNA meerdere keren kan worden afgelezen, is de levensduur in het cytoplasma erg belangrijk. De levensduur van het mRNA wordt door het mRNA zelf geregeld, meestal in een deel tussen het 3'-eind van het coderende deel en de poly-A-staart. Eiwitten waarvan er veel nodig zijn hebben mRNA dat lang leeft, eiwitten waarvan er weinig nodig of waarvan de kwantiteit snel moet kunnen veranderen hebben kort levend mRNA.

Essential cell biology, hoofdstuk 10: Analyzing genes and genomes

Pagina 340-343

De PCR-methode (polymerase chain reaction) wordt tegenwoordig het meest gebruikt voor het klonen van DNA. Met behulp van deze techniek kan een geselecteerde nucleotidesequentie snel worden gerepliceerd in grote aantallen. Het is gebaseerd op het gebruik van DNA-polymerase om een DNA-template te kopiëren in verschillende stappen. Er worden zogenaamde primers toegevoegd aan de reactie die het begin- en eindpunt aangeven van het stuk dat gekopieerd moet worden. De twee strengen van het dubbelstrengs DNA worden gescheiden en onafhankelijk van elkaar gekopieerd.

Er zijn verschillende handige toepassingen van PCR. Allereerst is het de eerste keuze om relatief korte DNA-fragmenten te klonen. Als originele template kan zowel DNA als RNA gebruikt worden, dus je kan een kopie krijgen compleet met alle introns en exonen of juist niet.

Een andere toepassing, die berust op de extreme gevoeligheid van PCR, is het detecteren van infecties in een vroeg stadium. Er worden dan korte sequenties gebruikt als primers, die complementair zijn aan het zieke gen, waarna er vele amplificatiecycli volgen. Zo kan de presentie of absentie van een binnengedrongen genoom gedetecteerd worden.

Ook zorgt PCR voor nieuwe mogelijkheden in de forensische geneeskunde. Er is maar heel weinig materiaal nodig om toch een DNA-fingerprint te kunnen maken. Het genoom van ieder individu is uniek wat betreft de DNA-sequenties. Zo kan van iedereen een kenmerkende DNA-fingerprint worden gemaakt.